湯雪燕　趙統(tǒng)利　邵小斌　朱朋波　劉興滿　孫明偉　徐燕

摘要：植物組織中普遍存在內(nèi)生菌，當(dāng)植物組織進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)，這些內(nèi)生菌就會(huì)產(chǎn)生污染。污染是植物組織培養(yǎng)中經(jīng)常遇到的問題，且很難控制。本文論述了植物組織的污染防治方法，并討論了抗生素使用的效果、穩(wěn)定性、注意事項(xiàng)以及對(duì)污染原因的判斷、污染苗搶救，以減少組織培養(yǎng)中的工作量，從而提高經(jīng)濟(jì)效益。

關(guān)鍵詞：組織培養(yǎng)；污染；防治；殺菌劑

中圖分類號(hào)： Q945.52文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0050-02

收稿日期：2013-05-08

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（10）115、CX（13）3014]；江蘇省連云港市科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：CN1203）；江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：湯雪燕（1983—），女，江蘇江陰人，碩士，助理研究員，主要從事植物營(yíng)養(yǎng)及花卉研究與技術(shù)推廣工作。Tel：（0518）85803250；E-mail：3202txy@163.com。廣義上植物組織培養(yǎng)是在人工控制條件下，把植物體的單個(gè)器官、組織或細(xì)胞從植物體分離后置于適宜營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境下，使之繼續(xù)生長(zhǎng)、分化并發(fā)育成完整再生植株的培養(yǎng)技術(shù)。近年來，植物組織培養(yǎng)作為一種生物技術(shù)已滲透到與之相關(guān)的農(nóng)業(yè)、林業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域的多個(gè)學(xué)科，為這些學(xué)科的發(fā)展提供了研究手段與理論基礎(chǔ)，同時(shí)創(chuàng)造了豐厚的經(jīng)濟(jì)效益。雖然組織培養(yǎng)的操作并不難，但對(duì)一些技術(shù)環(huán)節(jié)的要求卻十分嚴(yán)格，稍有疏忽便會(huì)延誤試驗(yàn)進(jìn)程，甚至導(dǎo)致整個(gè)試驗(yàn)失敗。利用組織培養(yǎng)進(jìn)行工廠化育苗時(shí)如發(fā)生污染，輕者影響繁殖計(jì)劃，影響當(dāng)季生產(chǎn)，重者造成珍貴品種丟失，組織培養(yǎng)室體系癱瘓。本文分析了組織培養(yǎng)工作中的污染防治問題，以期減少組織培養(yǎng)中的工作量，從而提高經(jīng)濟(jì)效益。

1植物組織培養(yǎng)中污染的來源

植物組織培養(yǎng)污染主要是由霉菌、細(xì)菌、酵母菌引起的污染。菌類傳播途徑有戶外風(fēng)傳播、渦流傳播、接種傳播，不正確操作也會(huì)增加污染概率，如滅菌不夠、操作過慢，另外還有內(nèi)生菌造成的潛伏性污染[1]。有些植物上昆蟲、螨蟲的體表帶有霉菌的孢子、細(xì)菌，在9—10月份是重要污染源，此時(shí)大量昆蟲造成的污染源最易造成組織培養(yǎng)污染的嚴(yán)重發(fā)生。

2植物組織培養(yǎng)中污染的防治

2.1細(xì)菌污染

2.1.1細(xì)菌污染定義細(xì)菌是處于生物和非生物之間的微生物。從形態(tài)上看，細(xì)菌可以分成球菌、桿菌、螺旋菌等3類。土壤、水、城市空氣里都有細(xì)菌散布，種類達(dá)50種以上[2]。

細(xì)菌污染是指在培養(yǎng)過程中，在培養(yǎng)基表面或材料表面出現(xiàn)黏液狀物體、菌落或渾濁水跡狀物質(zhì)，有時(shí)甚至出現(xiàn)泡沫發(fā)酵狀物質(zhì)。細(xì)菌污染又以芽孢桿菌污染最普遍、最嚴(yán)重，這種芽孢桿菌能耐一定高溫、高壓，對(duì)消毒劑和紫外線也有一定抗性，常由于高壓滅菌不徹底造成污染。細(xì)菌性污染主要是工作人員使用了未經(jīng)充分消毒的工具如剪刀、鑷子、三角瓶等，或是由呼吸排出的細(xì)菌，有時(shí)操作人員用手接觸材料或器具邊緣，使微生物落入培養(yǎng)基中，有時(shí)也會(huì)因剪取帶菌材料后沒消毒，用具又未徹底滅菌，極易造成污染。另外，由于組織培養(yǎng)室面積大、易污染，室內(nèi)溫度高，空氣濕度大，菌類繁殖旺盛也會(huì)加重污染[3]。

2.1.2細(xì)菌污染防治為了實(shí)現(xiàn)低污染率，在組織培養(yǎng)中除采用常規(guī)技術(shù)措施之外，還針對(duì)性地在培養(yǎng)基中加入殺菌劑如抗生素。抗生素作用原理：慶大霉素、鏈霉素屬于氨基糖苷類型，其與細(xì)菌中的30S核蛋白體亞單位結(jié)合，抑制細(xì)菌的油酸甘油酯合成，通過阻斷其代謝途徑使微生物致死。但抗生素也可能抑制植物組織的葉綠體和線粒體蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致植物葉片變小或變黃[4]，而且高濃度抗生素會(huì)影響植物生長(zhǎng)。在培養(yǎng)基中添加抗生素，選擇合適濃度非常關(guān)鍵，濃度低時(shí)效果差，濃度高時(shí)又容易對(duì)植物產(chǎn)生毒害，影響增殖或使培養(yǎng)材料變黑，出現(xiàn)死苗、白化苗等。

將2種及其以上的抗生素結(jié)合使用，可以防治細(xì)菌的抗藥性。韓美麗等在綠巨人組織培養(yǎng)研究中探討了青霉素、先鋒霉素、慶大霉素對(duì)繼代培養(yǎng)中細(xì)菌污染的抑制效果，指出先鋒霉素的抑菌效果最好，青霉素和慶大霉素次之[5]；翟建中等研究發(fā)現(xiàn)，鏈霉素能防治長(zhǎng)春蔓芽繼代培養(yǎng)中出現(xiàn)的細(xì)菌[6]。但也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下使用抗生素只能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)而不能將其殺死[7]，抗生素濃度太高對(duì)植物有一定毒害作用，而且抗生素一般不穩(wěn)定，遇酸、堿或加熱易分解而失去活性，這些問題使抗生素的使用受到限制[8]。因此，尋找穩(wěn)定、耐高溫和高壓的理想抗生素成為控制細(xì)菌污染的一個(gè)重要課題。

2.2真菌污染

2.2.1真菌污染定義真菌是一類沒有葉綠素、異養(yǎng)的真核微生物。室內(nèi)真菌種類主要有芽枝孢霉屬、曲霉屬、鉸鏈孢霉屬、鐮刀霉屬、青霉屬等。真菌以腐生、寄生或共生的形式進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)性生活。真菌數(shù)量與溫度、濕度有很大關(guān)系。春季、夏季尤其是南方的梅雨時(shí)節(jié)，溫暖潮濕，非常適合真菌生長(zhǎng)。冬季室內(nèi)真菌濃度較高，如果長(zhǎng)期使用空調(diào)而不注意通風(fēng)，可引起室內(nèi)真菌污染加重。真菌污染出現(xiàn)很快，一般接種后3～5 d 就發(fā)現(xiàn)菌絲，繼而很快出現(xiàn)黑、白、黃、綠等孢子。真菌污染一般是由空氣污染、瓶口邊緣和取放封口紙揚(yáng)起的灰塵、真菌孢子落入器皿中造成的。

2.2.2真菌污染防治常用的滅菌劑有70%乙醇、0.1%～1%氯化汞、3%～10%過氧化氫、1%～10%的漂白粉濾液、05%～10%次氯酸鈉溶液、4～50 mg/L 抗生素。70%乙醇?xì)⒕Ч?，有?rùn)濕作用，能排除外植體表層組織的空氣，但穿透力強(qiáng)，應(yīng)嚴(yán)格控制滅菌時(shí)間；氯化汞對(duì)外植體表面的滅菌效果最好，但殘留的重金屬汞難以去除，其毒害作用在培養(yǎng)一段時(shí)間后才能表現(xiàn)出來，因此滅菌后要將材料沖洗干凈；過氧化氫分解后生成有殺菌作用的氧氣，無毒害[9]；漂白粉殺菌效果很好，但須避光、干燥貯存；次氯酸鈉可分解生成有殺菌作用的氯氣而揮發(fā)；抗生素可用來去除材料內(nèi)部組織所帶菌類，但抑菌類型單一、藥效時(shí)間短、穩(wěn)定性差，容易使菌類產(chǎn)生抗藥性，濃度高時(shí)影響植物生長(zhǎng)，使其應(yīng)用受到限制[10]。為使滅菌劑能潤(rùn)濕整個(gè)組織表面，可在滅菌劑中加入數(shù)滴潤(rùn)濕劑吐溫-80或吐溫-20，可起到良好的滅菌效果[11]。

嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，定期用甲醛及高錳酸鉀熏蒸對(duì)組織培養(yǎng)室消毒。每次使用組織培養(yǎng)室或超凈工作臺(tái)時(shí)，先用紫外燈殺菌20～30 min，再用75%乙醇噴霧降塵。接種時(shí)用75%乙醇的棉球擦拭培養(yǎng)瓶外部，然后再放入超凈工作臺(tái)；接種時(shí)瓶子要放成45°角，放在火焰上方，利用氣流上升原理，以防止空氣中的孢子落入瓶?jī)?nèi)，取封口紙時(shí)動(dòng)作要輕。另外，如發(fā)現(xiàn)霉菌污染應(yīng)及時(shí)清除。對(duì)于外地引進(jìn)的試管苗，運(yùn)輸過程中瓶口及封口紙往往積灰塵和孢子，應(yīng)仔細(xì)用75%乙醇擦拭，接種時(shí)再燒瓶口，否則容易造成污染。為防止剛引進(jìn)的材料、剛獲得的無毒材料以及珍貴材料受到污染，用小培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，每瓶轉(zhuǎn)接1芽，雖然培養(yǎng)瓶數(shù)量增加，但這是防止稀缺材料污染損失的最有效途徑[12]。

有關(guān)抗生素消除細(xì)菌的研究較多，但目前對(duì)酵母菌污染的研究相對(duì)較少，Poulsen等在蘋果分裂組織微生物消除的研究中，測(cè)試了幾種物質(zhì)對(duì)酵母菌的毒性，雖然這些物質(zhì)對(duì)植物材料都沒有傷害，但沒有一種物質(zhì)能夠消除酵母菌。胍類化合物是唯一對(duì)2種酵母菌有毒的復(fù)合物，但它對(duì)分裂組織有毒害作用。霉菌污染的一個(gè)重要特點(diǎn)是迅速、難控制。目前關(guān)于真菌污染的研究還很少，有人建議用防腐劑去除真菌污染，但有關(guān)研究尚未見報(bào)道。

另外，培養(yǎng)基中存在有機(jī)物是污染產(chǎn)生的重要原因，去除有機(jī)物也是減少污染的一條途徑。宋鋒惠等在阿月渾子組織培養(yǎng)的研究中，除去培養(yǎng)基中的VB1、VB6、煙酸等有機(jī)成分（保留肌醇），經(jīng)2～3代培養(yǎng)后，能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，對(duì)叢生芽生長(zhǎng)增殖沒有影響。原因是這些有機(jī)成分是某些細(xì)菌生長(zhǎng)的必需物質(zhì)，除去這些有機(jī)物后，細(xì)菌無法生長(zhǎng)發(fā)育而逐漸死亡[13]。日本古在豐樹首創(chuàng)的植物無糖組織培養(yǎng)快繁技術(shù)則完全除去了培養(yǎng)基中的有機(jī)成分，輸入可控制量的CO2氣體作為碳源，并通過控制環(huán)境因子，促進(jìn)植株光合作用速率，使之由異養(yǎng)型轉(zhuǎn)變?yōu)樽责B(yǎng)型，因而植株長(zhǎng)勢(shì)良好，污染率明顯降低[14]。由于去除了糖，組織培養(yǎng)苗由玻璃瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)改為箱式大容器培養(yǎng)，也可將整個(gè)培養(yǎng)室作為培養(yǎng)容器，甚至不需要嚴(yán)格的無菌操作，也極少被污染，這項(xiàng)技術(shù)至少在許多植物組織培養(yǎng)苗的促根階段應(yīng)用比較成功。

3植物組織培養(yǎng)中污染原因判斷及污染苗搶救

3.1污染原因判斷

如果污染菌類是零星分散在培養(yǎng)基中，則可確定是人為引起的污染。如培養(yǎng)基、接種用具滅菌不徹底；接種室長(zhǎng)期不滅菌，接種臺(tái)擺放物品雜亂，菌類太多；超凈工作臺(tái)長(zhǎng)期未換濾網(wǎng)，使凈化能力降低；工作人員操作不正確，動(dòng)作生硬緩慢，開瓶時(shí)間過長(zhǎng)，操作中心在人體范圍內(nèi)。

如果污染菌類是從材料周圍長(zhǎng)起，則證明是植物材料帶菌引起，可能是接種工具滅菌不徹底，接種時(shí)材料被污染；或是未及時(shí)發(fā)現(xiàn)污染苗，接種過程中交叉感染。

如果污染菌類是從培養(yǎng)基以上部分長(zhǎng)起，而不是先從培養(yǎng)基長(zhǎng)起，且發(fā)生在5 d以后，則說明是材料自帶的內(nèi)生菌。

如果污染菌類是從培養(yǎng)基以下開始長(zhǎng)菌，發(fā)生時(shí)間較早，且有從里向外發(fā)展的趨勢(shì)，則說明是切口引起的污染，原因是滅菌后未剪去2個(gè)切口或雖剪切口但器具帶菌。

3.2污染苗搶救

細(xì)菌被污染后，由于細(xì)菌繁殖靠芽孢，細(xì)菌不會(huì)彌散整個(gè)空間，因此只要及時(shí)發(fā)現(xiàn)，將材料上部未感菌部分去除轉(zhuǎn)接，材料仍然可以用；但若真菌被污染，則必須經(jīng)高溫、高壓滅菌后扔掉，即使僅形成菌絲，因?yàn)榫z能到達(dá)材料內(nèi)部，真菌污染是滅絕性的。

用抗生素等殺菌劑處理，雖有不少報(bào)道，但至今未發(fā)現(xiàn)有抗生素能對(duì)各種菌都有效，并且常會(huì)影響植物材料的正常生長(zhǎng)分化。有的另一些藥劑雖殺菌效果好，但往往容易引起鹽害，無法利用。

對(duì)已污染的培養(yǎng)物，有時(shí)因植物材料難得或重新發(fā)生要花費(fèi)很多時(shí)間，也可切取較大植株重新消毒接種。李春燕等分別用400萬、600萬單位/L青霉素?zé)o菌水溶液浸泡銀白楊組織培養(yǎng)細(xì)菌污染苗40 min以上，可有效防治組織培養(yǎng)中的細(xì)菌污染。處理過的苗繼代培養(yǎng)時(shí)，不再重復(fù)出現(xiàn)細(xì)菌污染現(xiàn)象，且苗分化能力強(qiáng)，生根培養(yǎng)時(shí)根系發(fā)達(dá)，移栽成活率高[15]。李穎等研究證明，如果繼代培養(yǎng)中只有真菌污染，采用3%多菌靈無菌液浸泡0.5 h以上即可，用無菌水沖洗后接種或不用無菌水沖洗直接接種都可消除真菌污染。如果在細(xì)菌污染和細(xì)菌、真菌同時(shí)污染的情況下，可采用 HgCl2消毒法把污染培養(yǎng)苗切割成較長(zhǎng)莖段作外植體，用自來水沖洗 0.5 h，再在超凈工作臺(tái)上用乙醇和HgCl2進(jìn)行短時(shí)間處理，即可再度建立無菌苗培養(yǎng)體系[16]。

4結(jié)論

傳統(tǒng)組織培養(yǎng)過程繁雜的技術(shù)環(huán)節(jié)都是圍繞防止污染而制定，控制污染成為組織培養(yǎng)中的首要技術(shù)，而植物組織培養(yǎng)污染的控制取決于滅菌技術(shù)、滅菌設(shè)備、外植體年齡、環(huán)境條件等許多方面。盡管在植物組織培養(yǎng)過程中盡量使無菌條件更完善，但污染還是經(jīng)常發(fā)生，甚至有時(shí)整個(gè)實(shí)驗(yàn)室的組織培養(yǎng)苗突然被污染而全部死亡，造成巨大損失，因而人們對(duì)細(xì)菌污染研究較多。有些研究人員希望用抗生素防治細(xì)菌污染，抗生素可以被直接加入到培養(yǎng)基中，也可以用抗生素噴灑或浸泡外植體?？傊?，針對(duì)不同植物品種要想找到一種合適的抗生素處理組合比較困難，工作也較繁瑣。一般認(rèn)為，沒有一

種抗生素對(duì)所有細(xì)菌都有效，即使有效，抗生素消除植物組織培養(yǎng)污染的方法也是暫時(shí)解決方案，如果為消除污染而長(zhǎng)期使用抗生素，必然對(duì)組織培養(yǎng)苗的生長(zhǎng)、分化、生根產(chǎn)生一定影響。隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展和進(jìn)步，將會(huì)出現(xiàn)更高效、節(jié)能的新設(shè)備、新技術(shù)、新方法應(yīng)用于組織培養(yǎng)技術(shù)，從而有效控制污染發(fā)生。

參考文獻(xiàn)：

[1]葉添謀. 植物組織培養(yǎng)過程中的常見技術(shù)難題研究進(jìn)展[J]. 韶關(guān)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，31（3）：84-90.

[2]吳林森. 植物組織培養(yǎng)污染問題的研究及其控制措施[J]. 江蘇林業(yè)科技，2005，32（1）：130-134.

[3]李 云. 林果花菜組織培養(yǎng)快速育苗技術(shù)[M]. 北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2001.

[4]Reed B M，Mentzer J，Tanprasert P，et al. Internal bacterial contamination of micropropagated hazelnut：identification and antibiotic treatment[J]. Plant Cell，2004，87（1）：171-176.

[5]韓美麗，陸榮生，黃華艷，等. 綠巨人組培苗繼代培養(yǎng)過程中玻璃化苗及細(xì)菌污染的消除方法研究[J]. 廣西林業(yè)科學(xué)，1999，28（1）：16-19.

[6]翟建中，顧梅俏. 長(zhǎng)春蔓組培生產(chǎn)中污染菌的防除[J]. 森林病蟲通訊，1999（4）：30-32.

[7]于?？疲瑥垙V軍. 玫瑰組織培養(yǎng)污染控制技術(shù)措施[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002（11）：47-48.

[8]周俊輝，周厚高，劉花全. 植物組織培養(yǎng)中的內(nèi)生細(xì)菌污染問題[J]. 廣西植物，2003，23（1）：41-47.

[9]王利民，周毅，陳龍友，等. 植物組織培養(yǎng)中消毒劑的運(yùn)用[J]. 貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，20（1）：15-17.

[10]王黎波，李曉燕.抗生素在植物組織培養(yǎng)中控制污染的應(yīng)用[J]. 遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（3）：69-70.

[11]紀(jì)純陽，矯麗曼，劉巍，等. 植物組織培養(yǎng)中污染產(chǎn)生的原因及防止措施[J]. 遼寧林業(yè)科技，2011（2）：40-44.

[12]郝云鳳，李可偉，張培宏，等. 植物組織培養(yǎng)操作過程中常見的污染問題及解決辦法[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2004（增刊）：156-158.

[13]宋鋒惠，李康，史彥江.阿月渾子組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)研究[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，39（6）：343-345.

[14]肖玉蘭.植物無糖組培快繁工廠化生產(chǎn)技術(shù)[M]. 昆明：云南科技出版社，2003：1-4.

[15]李春燕，李穎. 組織培養(yǎng)中青霉素對(duì)細(xì)菌污染的抑制作用[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，28（5）：97-98.

[16]李穎，李春燕.多菌靈和青霉素在組培污染中的應(yīng)用[J]. 林業(yè)科技，2002，27（1）：6-8.陸玉建， 劉俊華， 王書平，等. 本生煙草愈傷組織的誘導(dǎo)和再生體系的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：52-54.