羅蕊+趙志強(qiáng)+黃鳳蘭等
摘要:本研究?jī)?yōu)化了從蓖麻葉片中提取蛋白的過(guò)程,利用硫酸鹽沉淀法、BCA試劑盒、UVwin5紫外軟件V5.1.0、BandScan蛋白定量分析軟件相結(jié)合的方法對(duì)蓖麻組培苗不同部位葉片中的毒蛋白的含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明,蓖麻葉片中毒蛋白的含量與葉位呈正比。
關(guān)鍵詞:蓖麻;蓖麻毒蛋白;含量;葉位;硫酸鹽沉淀法
中圖分類號(hào): S565.601文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2014)02-0043-03
收稿日期:2013-05-30
基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):30760123、31060194);國(guó)家民族事務(wù)委員會(huì)項(xiàng)目(編號(hào):10NM02);內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(編號(hào):2010BS0511);內(nèi)蒙古人才基金。
作者簡(jiǎn)介:羅蕊(1988—),女,內(nèi)蒙古扎蘭屯人,碩士研究生,主要從事植物基因工程研究。E-mail:luorui19880629@163.com。
通信作者:陳永勝,博士,教授,主要從事植物基因工程研究工作。E-mail:chenys-2012@hotmail.com。蓖麻(Ricinus communis L.),大戟科,世界十大油料作物之一[1],具有很高的應(yīng)用價(jià)值[2-5]。蓖麻中有毒的物質(zhì)主要包括蓖麻堿、蓖麻毒蛋白、變應(yīng)原、血球凝集素這4種物質(zhì),都具有很大的毒性。蓖麻毒蛋白是一種蛋白分解酶,是由毒類素、全毒素、凝集素這3種物質(zhì)組成的蛋白質(zhì)[6],其相對(duì)分子量為64 000左右,也有報(bào)道為36 000~85 000。蓖麻毒素(ricin)為白色粉末狀或結(jié)晶狀,無(wú)味,不溶于有機(jī)溶劑,在飽和的硫酸銨溶液中能沉淀析出。蓖麻毒蛋白由A、B 2條鏈組成。A鏈?zhǔn)切?yīng)鏈,是一種具有N-糖苷酶活性的多肽;B鏈有凝集素的活性,能與細(xì)胞上的半乳糖的糖蛋白結(jié)合[7]。蓖麻提取物具有殺蟲的特性,適用于開發(fā)生物農(nóng)藥。曾有人對(duì)蓖麻不同部位蓖麻堿的含量進(jìn)行測(cè)定[8],但至今國(guó)內(nèi)還沒有人測(cè)定過(guò)蓖麻不同時(shí)期葉片中毒蛋白的含量。本試驗(yàn)采用硫酸銨沉淀法、BCA蛋白試劑盒法、UVwin5紫外軟件v5.1.0、BandScan蛋白定量分析軟件相結(jié)合的方法,對(duì)蓖麻毒蛋白在蓖麻不同部位葉片中含量進(jìn)行簡(jiǎn)單、快速、精確的分析測(cè)定,為研究蓖麻毒蛋白在植株各部位的含量分析奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
植物材料為通蓖5號(hào)蓖麻組織培養(yǎng)苗,由內(nèi)蒙古民族大學(xué)蓖麻工程研究中心提供。
1.2儀器與試劑
Hema冷凍離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司);DYY-6C 型電泳儀(北京市六一儀器廠);紫外可見分光光度計(jì)-T6新世紀(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);BCA蛋白定量試劑盒(北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司);BandScan蛋白定量分析軟件。
1.3試驗(yàn)方法
1.3.1 蓖麻粗蛋白的提取參照曾佑煒等的方法[9],對(duì)每1 g葉片中磷酸緩沖液的加入量和PEG的分子質(zhì)量進(jìn)行優(yōu)化,同時(shí)對(duì)比冷藏葉片和新鮮葉片的提取效果,從而確定試驗(yàn)方法。取3株蓖麻組織培養(yǎng)苗,稱取約1 g蓖麻不同部位的葉片,在液氮中充分研磨;按照1 g葉片加入10 mL 5mmol/L磷酸緩沖液(PBS,pH值6.5,含100 mmol/L NaCl,稱為緩沖液A)的比例加入,并充分混勻;4 ℃放置過(guò)夜;4 ℃下17 000 r/min離心30 min,小心去除沉淀和白色脂肪;重復(fù)離心1次,取上清;在上清中加入固體(NH4)2SO4,達(dá)到60%飽和度;4 ℃放置 3 h;4 ℃下17 000 r/min離心30 min;倒去上清,把沉淀溶解在緩沖液A中;裝入透析袋(截留分子量:8 000~14 000),用PEG(分子量20 000)包埋后4 ℃透析3 h;4 ℃下 17 000 r/min 離心30 min,取上清即為毒蛋白粗品,記錄所得的粗蛋白的體積,并設(shè)置3個(gè)重復(fù)。
1.3.2蓖麻粗蛋白含量的測(cè)定
1.3.2.1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的操作步驟參照北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明,得到濃度計(jì)算公式:C=k1×D562 nm+k0,其中:k0=-0.080 91,k1=0.982 79,D562 nm為波長(zhǎng)為562 nm處吸光度,相關(guān)性為0.999 7。
1.3.2.2粗蛋白濃度測(cè)定取一定量粗蛋白,稀釋100倍后測(cè)D562 nm,并根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算稀釋100倍后粗蛋白的濃度μg/μL)。粗蛋白濃度C(μg/μL)=(k1×稀釋100倍后的D562 nm+k0)×100。
1.3.2.3粗蛋白含量的計(jì)算根據(jù)粗蛋白的濃度、粗蛋白的體積和每個(gè)樣品中提取粗蛋白時(shí)葉片的重量,計(jì)算出每1 g葉片粗蛋白的含量。粗蛋白含量(mg)=稀釋100倍后濃度(μg/μL)×粗蛋白體積(mL)。1 g葉片粗蛋白含量(mg/g)=葉片中粗蛋白含量(mg)/葉片重量(g)。
1.3.3蓖麻毒蛋白含量的測(cè)定
1.3.3.1粗蛋白的SDS-PAGE電泳用12%的膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳,每個(gè)點(diǎn)樣孔上樣量為30 μL。
1.3.3.2蛋白條帶灰度比重分析具體操作步驟參見BandScan軟件操作說(shuō)明。得到每個(gè)品種中每種蛋白質(zhì)占粗蛋白的灰度百分比。
1.3.3.3毒蛋白含量計(jì)算根據(jù)BandScan軟件分析毒蛋白占粗蛋白灰度百分比和每1 g葉片中粗蛋白含量,計(jì)算每1 g葉子中毒蛋白的含量。每1 g葉子中毒蛋白的含量(mg/g)=每1 g葉片粗蛋白含量(mg/g)×毒蛋白占粗蛋白的灰度百分比。
2結(jié)果與分析
2.1蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
利用BCA法繪制的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。從圖1可以看出,所制作的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量較好。
2.2蓖麻粗蛋白含量的測(cè)定
對(duì)3株蓖麻粗蛋白含量的測(cè)定結(jié)果見表1。
從表1可以看出:第1株蓖麻不同部位葉片中粗蛋白含量從真葉8到真葉14依次為6.177、3.717、6.266、4.190、7149、12.399、5.673 mg/g;第2株蓖麻不同部位葉片中粗蛋
2.3粗蛋白的SDS-PAGE電泳
3株蓖麻不同部位葉片粗蛋白電泳結(jié)果見圖2。從圖2可以看出,毒蛋白分子量為32.0 ku和34.0 ku的2條帶相距非常近,在電泳圖中2條帶有重疊的部分。
2.4毒蛋白占粗蛋白的灰度百分比分析
BandScan蛋白定量分析軟件對(duì)3個(gè)植株不同部位葉片粗蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果進(jìn)行分析,得出各種蛋白占粗蛋白的灰度百分比,由于每個(gè)葉片的條帶數(shù)不同,所以毒蛋白在分析時(shí)不在一條直線上。另外毒蛋白的2條帶分子量差異較小,電泳過(guò)程中有些出現(xiàn)2條帶重疊現(xiàn)象,導(dǎo)致軟件分析時(shí),被認(rèn)為是1條帶,但不影響軟件的最后分析結(jié)果。
對(duì)3株蓖麻的蛋白灰度分析見圖3和表1。
由表1和圖3可以看出:第1株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉8到真葉14依次為23%、1.6%、0、0.8%、0、0.5%、0.6%;第2株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉11到真葉19依次為2.7%、3.5%、1.4%、2.8%、2.4%、2.7%、4.0%、20%、1.3%;第3株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉13到真葉18依次為2.0%、2.4%、33%、3.3%、4.0%、2.6%。
2.5毒蛋白含量計(jì)算
對(duì)3株蓖麻中毒蛋白的含量計(jì)算結(jié)果見表1。
由表1可以看出,第1株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉8到真葉14依次為0.142 07、0.059 47、0、0.033 52、0、0.620 0、0.034 04 mg/g;第2株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉11到真葉19依次為0.320 84、0.317 56、
0.151 00、0.445 73、0.227 30、0.176 61、0.432 24、0.125 56、0.219 56 mg/g;第3株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉13到真葉18依次為0.523 72、0.514 97、0.910 07、0.938 42、1.241 16、0.627 93 mg/g。
根據(jù)表1求出每個(gè)葉片中含有毒蛋白的平均含量,結(jié)果見表2。
由圖4可以看出,不同部位蓖麻葉片中的毒蛋白的含量隨著葉位的增大而增加。
3結(jié)論與討論
從總體上看,蓖麻葉片中的毒蛋白的含量與葉位呈正比。
蓖麻提取物中的主要?dú)⑾x物物質(zhì)為蓖麻毒蛋白和蓖麻堿,蓖麻毒蛋白主要具有觸殺作用,蓖麻堿則主要具有觸殺胃
毒和一定的拒食作用[10]。蓖麻毒蛋白用于制造生物農(nóng)藥具有很好的前景。在條件優(yōu)化過(guò)程中發(fā)現(xiàn),經(jīng)冷凍的葉片中毒蛋白的含量低于新鮮葉片中毒蛋白的含量,葉片在冷凍過(guò)程中毒蛋白會(huì)降解;老葉片中毒蛋白的含量低于幼嫩的葉片中毒蛋白的含量,隨著葉片中粗纖維的增加,蛋白質(zhì)總量減少,同時(shí)毒蛋白的含量也減少。
蓖麻籽主要用于榨油,經(jīng)高溫處理后,蓖麻中的主要毒性物質(zhì)只有變性原和蓖麻堿,餅粕可用于提取蓖麻堿。蓖麻的葉片主要用于秸稈還田,利用蓖麻葉片提取蓖麻毒蛋白有利于對(duì)蓖麻的充分利用,減少資源浪費(fèi),有助于開發(fā)新型生物農(nóng)藥,本研究為蓖麻毒蛋白在整株蓖麻葉片的分布奠定了基礎(chǔ),有利于農(nóng)藥開發(fā)的后續(xù)研究。
參考文獻(xiàn):
[1]張寶賢,譚德云,劉紅光,等. 我國(guó)蓖麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展及其能源化利用的探討[J]. 農(nóng)業(yè)科技通訊,2010(1):22-23.
[2]潘國(guó)才,丁愛華.蓖麻的綜合利用現(xiàn)狀[J]. 農(nóng)業(yè)科技與裝備,2009(1):1-2,5.
[3]蘇雅拉圖. 蓖麻抗生育研究進(jìn)展[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2011,26(3):316-319.
[4]張紅菊,趙懷勇. 蓖麻對(duì)鹽漬土的改良效果研究[J]. 中國(guó)水土保持,2010(7):43-44,66.
[5]張智勇,陳永勝,倪娜,等. 蓖麻產(chǎn)品在農(nóng)藥中的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技,2011(6):74-76.
[6]趙青余,桂榮,那日蘇.蓖麻餅脫毒的研究進(jìn)展[J]. 飼料工業(yè),2002,23(11):35-39.
[7]孫媚華,陳遷,宋光泉,等. 蓖麻毒蛋白的研究與應(yīng)用[J]. 廣東化工,2009,36(9):144-145,162.
[8]溫燕梅,馮亞非,鄭明珠.蓖麻不同部位殺蟲活性成分蓖麻堿的提取及含量[J]. 農(nóng)藥,2008,47(8):584-585,606.
[9]曾佑煒,宋光泉,彭永宏,等. 蓖麻毒蛋白的分離純化和毒理作用研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2004,20(4):23-25,32.
[10]趙建興,張樹懷,佘國(guó)珍,等. 蓖麻毒素粗提物殺蟲作用的研究[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2001,22(4):78-80.
2.2蓖麻粗蛋白含量的測(cè)定
對(duì)3株蓖麻粗蛋白含量的測(cè)定結(jié)果見表1。
從表1可以看出:第1株蓖麻不同部位葉片中粗蛋白含量從真葉8到真葉14依次為6.177、3.717、6.266、4.190、7149、12.399、5.673 mg/g;第2株蓖麻不同部位葉片中粗蛋
2.3粗蛋白的SDS-PAGE電泳
3株蓖麻不同部位葉片粗蛋白電泳結(jié)果見圖2。從圖2可以看出,毒蛋白分子量為32.0 ku和34.0 ku的2條帶相距非常近,在電泳圖中2條帶有重疊的部分。
2.4毒蛋白占粗蛋白的灰度百分比分析
BandScan蛋白定量分析軟件對(duì)3個(gè)植株不同部位葉片粗蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果進(jìn)行分析,得出各種蛋白占粗蛋白的灰度百分比,由于每個(gè)葉片的條帶數(shù)不同,所以毒蛋白在分析時(shí)不在一條直線上。另外毒蛋白的2條帶分子量差異較小,電泳過(guò)程中有些出現(xiàn)2條帶重疊現(xiàn)象,導(dǎo)致軟件分析時(shí),被認(rèn)為是1條帶,但不影響軟件的最后分析結(jié)果。
對(duì)3株蓖麻的蛋白灰度分析見圖3和表1。
由表1和圖3可以看出:第1株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉8到真葉14依次為23%、1.6%、0、0.8%、0、0.5%、0.6%;第2株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉11到真葉19依次為2.7%、3.5%、1.4%、2.8%、2.4%、2.7%、4.0%、20%、1.3%;第3株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉13到真葉18依次為2.0%、2.4%、33%、3.3%、4.0%、2.6%。
2.5毒蛋白含量計(jì)算
對(duì)3株蓖麻中毒蛋白的含量計(jì)算結(jié)果見表1。
由表1可以看出,第1株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉8到真葉14依次為0.142 07、0.059 47、0、0.033 52、0、0.620 0、0.034 04 mg/g;第2株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉11到真葉19依次為0.320 84、0.317 56、
0.151 00、0.445 73、0.227 30、0.176 61、0.432 24、0.125 56、0.219 56 mg/g;第3株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉13到真葉18依次為0.523 72、0.514 97、0.910 07、0.938 42、1.241 16、0.627 93 mg/g。
根據(jù)表1求出每個(gè)葉片中含有毒蛋白的平均含量,結(jié)果見表2。
由圖4可以看出,不同部位蓖麻葉片中的毒蛋白的含量隨著葉位的增大而增加。
3結(jié)論與討論
從總體上看,蓖麻葉片中的毒蛋白的含量與葉位呈正比。
蓖麻提取物中的主要?dú)⑾x物物質(zhì)為蓖麻毒蛋白和蓖麻堿,蓖麻毒蛋白主要具有觸殺作用,蓖麻堿則主要具有觸殺胃
毒和一定的拒食作用[10]。蓖麻毒蛋白用于制造生物農(nóng)藥具有很好的前景。在條件優(yōu)化過(guò)程中發(fā)現(xiàn),經(jīng)冷凍的葉片中毒蛋白的含量低于新鮮葉片中毒蛋白的含量,葉片在冷凍過(guò)程中毒蛋白會(huì)降解;老葉片中毒蛋白的含量低于幼嫩的葉片中毒蛋白的含量,隨著葉片中粗纖維的增加,蛋白質(zhì)總量減少,同時(shí)毒蛋白的含量也減少。
蓖麻籽主要用于榨油,經(jīng)高溫處理后,蓖麻中的主要毒性物質(zhì)只有變性原和蓖麻堿,餅粕可用于提取蓖麻堿。蓖麻的葉片主要用于秸稈還田,利用蓖麻葉片提取蓖麻毒蛋白有利于對(duì)蓖麻的充分利用,減少資源浪費(fèi),有助于開發(fā)新型生物農(nóng)藥,本研究為蓖麻毒蛋白在整株蓖麻葉片的分布奠定了基礎(chǔ),有利于農(nóng)藥開發(fā)的后續(xù)研究。
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[6]趙青余,桂榮,那日蘇.蓖麻餅脫毒的研究進(jìn)展[J]. 飼料工業(yè),2002,23(11):35-39.
[7]孫媚華,陳遷,宋光泉,等. 蓖麻毒蛋白的研究與應(yīng)用[J]. 廣東化工,2009,36(9):144-145,162.
[8]溫燕梅,馮亞非,鄭明珠.蓖麻不同部位殺蟲活性成分蓖麻堿的提取及含量[J]. 農(nóng)藥,2008,47(8):584-585,606.
[9]曾佑煒,宋光泉,彭永宏,等. 蓖麻毒蛋白的分離純化和毒理作用研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2004,20(4):23-25,32.
[10]趙建興,張樹懷,佘國(guó)珍,等. 蓖麻毒素粗提物殺蟲作用的研究[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2001,22(4):78-80.
2.2蓖麻粗蛋白含量的測(cè)定
對(duì)3株蓖麻粗蛋白含量的測(cè)定結(jié)果見表1。
從表1可以看出:第1株蓖麻不同部位葉片中粗蛋白含量從真葉8到真葉14依次為6.177、3.717、6.266、4.190、7149、12.399、5.673 mg/g;第2株蓖麻不同部位葉片中粗蛋
2.3粗蛋白的SDS-PAGE電泳
3株蓖麻不同部位葉片粗蛋白電泳結(jié)果見圖2。從圖2可以看出,毒蛋白分子量為32.0 ku和34.0 ku的2條帶相距非常近,在電泳圖中2條帶有重疊的部分。
2.4毒蛋白占粗蛋白的灰度百分比分析
BandScan蛋白定量分析軟件對(duì)3個(gè)植株不同部位葉片粗蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果進(jìn)行分析,得出各種蛋白占粗蛋白的灰度百分比,由于每個(gè)葉片的條帶數(shù)不同,所以毒蛋白在分析時(shí)不在一條直線上。另外毒蛋白的2條帶分子量差異較小,電泳過(guò)程中有些出現(xiàn)2條帶重疊現(xiàn)象,導(dǎo)致軟件分析時(shí),被認(rèn)為是1條帶,但不影響軟件的最后分析結(jié)果。
對(duì)3株蓖麻的蛋白灰度分析見圖3和表1。
由表1和圖3可以看出:第1株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉8到真葉14依次為23%、1.6%、0、0.8%、0、0.5%、0.6%;第2株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉11到真葉19依次為2.7%、3.5%、1.4%、2.8%、2.4%、2.7%、4.0%、20%、1.3%;第3株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白占粗蛋白的灰度的百分比從真葉13到真葉18依次為2.0%、2.4%、33%、3.3%、4.0%、2.6%。
2.5毒蛋白含量計(jì)算
對(duì)3株蓖麻中毒蛋白的含量計(jì)算結(jié)果見表1。
由表1可以看出,第1株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉8到真葉14依次為0.142 07、0.059 47、0、0.033 52、0、0.620 0、0.034 04 mg/g;第2株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉11到真葉19依次為0.320 84、0.317 56、
0.151 00、0.445 73、0.227 30、0.176 61、0.432 24、0.125 56、0.219 56 mg/g;第3株蓖麻不同部位葉片中毒蛋白含量從真葉13到真葉18依次為0.523 72、0.514 97、0.910 07、0.938 42、1.241 16、0.627 93 mg/g。
根據(jù)表1求出每個(gè)葉片中含有毒蛋白的平均含量,結(jié)果見表2。
由圖4可以看出,不同部位蓖麻葉片中的毒蛋白的含量隨著葉位的增大而增加。
3結(jié)論與討論
從總體上看,蓖麻葉片中的毒蛋白的含量與葉位呈正比。
蓖麻提取物中的主要?dú)⑾x物物質(zhì)為蓖麻毒蛋白和蓖麻堿,蓖麻毒蛋白主要具有觸殺作用,蓖麻堿則主要具有觸殺胃
毒和一定的拒食作用[10]。蓖麻毒蛋白用于制造生物農(nóng)藥具有很好的前景。在條件優(yōu)化過(guò)程中發(fā)現(xiàn),經(jīng)冷凍的葉片中毒蛋白的含量低于新鮮葉片中毒蛋白的含量,葉片在冷凍過(guò)程中毒蛋白會(huì)降解;老葉片中毒蛋白的含量低于幼嫩的葉片中毒蛋白的含量,隨著葉片中粗纖維的增加,蛋白質(zhì)總量減少,同時(shí)毒蛋白的含量也減少。
蓖麻籽主要用于榨油,經(jīng)高溫處理后,蓖麻中的主要毒性物質(zhì)只有變性原和蓖麻堿,餅粕可用于提取蓖麻堿。蓖麻的葉片主要用于秸稈還田,利用蓖麻葉片提取蓖麻毒蛋白有利于對(duì)蓖麻的充分利用,減少資源浪費(fèi),有助于開發(fā)新型生物農(nóng)藥,本研究為蓖麻毒蛋白在整株蓖麻葉片的分布奠定了基礎(chǔ),有利于農(nóng)藥開發(fā)的后續(xù)研究。
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