李騏　李瓊芳　王建萍　馬政慶　包莉萍　喬銳　鄧雄

摘要：對(duì)2株分離自黃龍冷水型水體的土著細(xì)菌020-18、021-3生長(zhǎng)各階段的胞外有機(jī)酸代謝組分進(jìn)行了表征分析。結(jié)果表明：在遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期及衰亡期等各個(gè)生長(zhǎng)階段，2菌株向胞外分泌7種有機(jī)酸的成分及含量各異；在對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期生長(zhǎng)階段，2菌株在胞外積累了蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸等有機(jī)酸。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；細(xì)菌；有機(jī)酸；黃龍風(fēng)景區(qū)

中圖分類號(hào)： Q657.7+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0274-04

收稿日期：2013-08-27

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金主任基金（編號(hào)：41040004）。

作者簡(jiǎn)介：李騏言（1988—），女，福建龍巖人，碩士研究生，從事微生物研究。E-mail：leeqiyan@163.com。

通信作者：李瓊芳，博士，副教授，主要從事微生物研究。E-mail：liqiongfang1992@126.com。黃龍風(fēng)景區(qū)位于四川省阿壩藏族羌族自治州松潘縣內(nèi)，海拔3 145～3 578 m ，溝內(nèi)鈣華沉積長(zhǎng)3.6 km，寬110～250 m，厚9～20 m，其獨(dú)特的鈣華沉積景觀色彩絢麗，于1992年被聯(lián)合國(guó)教科文組織列為世界自然遺產(chǎn)，是我國(guó)最為珍貴的自然景觀之一。鈣華景觀的形成主要是CaCO3—H2O—CO2三相相互作用的結(jié)果[1]。目前國(guó)內(nèi)眾多學(xué)者對(duì)于鈣、水的來源已經(jīng)基本達(dá)成了共識(shí)[2]，但對(duì)于CO2的來源主要存在2種觀點(diǎn)，即冷成因論[3]（或氣候成因論）與熱成因論[4]（深成因論）。冷成因論認(rèn)為，CO2主要來源于土壤及大氣，認(rèn)為生物成因、大氣成因占主導(dǎo)作用；熱成因論認(rèn)為，CO2主要來自地球內(nèi)部。鈣化景區(qū)冷水型水體中土著微生物通過自身呼吸作用產(chǎn)生并釋放的CO2作為灰?guī)r的侵蝕溶解動(dòng)力是很有可能的，但更為重要的是微生物能通過自身代謝產(chǎn)物（如有機(jī)酸、氨基酸、多糖、蛋白質(zhì)等）對(duì)碳酸鹽巖的沉積產(chǎn)生巨大影響。有學(xué)者認(rèn)為，微生物碳酸鹽巖沉積作用的發(fā)生主要是建立在胞外聚合物（EPS）、微生物膜（biofilm）、微生物席（microbial mat）等生物基礎(chǔ)之上的[5-6]。微生物通過向胞外分泌EPS，不斷捕捉及黏附鈣離子，將微小晶粒附著于微生物膜（亞毫米級(jí)）上。微生物膜在捕捉、黏附的同時(shí)也可通過自身不斷生長(zhǎng)成更厚的微生物席（毫米級(jí)），進(jìn)而對(duì)較大的沉積顆粒進(jìn)行捕捉、黏附，最終形成微生物碳酸鹽巖。近年來，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)微生物介導(dǎo)的碳酸鹽巖沉積物進(jìn)行了大量研究，肯定了碳酸鹽巖沉積形成過程中微生物所起的重要作用。邢智峰等發(fā)現(xiàn)，在西云夢(mèng)山組地層的縱剖面上，毫米級(jí)的深色沉積物層、淺色石英顆粒層交替出現(xiàn)，形成了典型的微生物席紋層，表明微生物在沉積表面發(fā)生多次生長(zhǎng)、埋藏[7]。唐鑫萍等認(rèn)為，山東省平邑盆地古近系湖相的3種微生物碳酸鹽巖（核形石、疊層石、凝塊石）是以微生物成因組構(gòu)（EPS、微生物膜、微生物席）、微生物作用為共同基礎(chǔ)在不同的環(huán)境條件下形成的[8]。Kenward等證實(shí)了白云石沉淀發(fā)生在異化型鐵還原菌停止活動(dòng)而產(chǎn)甲烷古菌新陳代謝活動(dòng)繁盛后，證明產(chǎn)甲烷菌能夠促進(jìn)白云石在低溫下沉淀[9]。Tong等研究發(fā)現(xiàn)，左旋天冬氨酸單體的添加對(duì)碳酸球文石晶型的形成具有特殊的調(diào)節(jié)作用[10]。周雪瑩等發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)芽孢桿菌在不同的培養(yǎng)條件下由于數(shù)量、莢膜多糖、碳酸酐酶活性的差異使得碳酸鈣晶體的數(shù)量、形貌差異較大[11]。由此可見，微生物及其豐富的胞外代謝產(chǎn)物對(duì)碳酸鈣晶體中晶型及形貌的影響不可忽視。本研究以探究黃龍風(fēng)景區(qū)土著微生物胞外有機(jī)酸在鈣華景觀形貌形成中的參與程度為出發(fā)點(diǎn)，對(duì)黃龍風(fēng)景區(qū)特殊冷水型水體中土著細(xì)菌在各個(gè)生長(zhǎng)階段所分泌的胞外有機(jī)酸組分進(jìn)行了分析，旨在為揭示黃龍風(fēng)景區(qū)鈣華景觀形成的生物成因提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株從黃龍冷水型水體中分離篩選出2株具有較大莢膜的細(xì)菌菌株（編號(hào)：020-18、021-3）。

1.1.2有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液精確稱取草酸0.05 g，乳酸、冰乙酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸各0.5 g。用超純水溶解并定容至100 mL容量瓶，得到混合標(biāo)準(zhǔn)酸儲(chǔ)備液，密封并于4 ℃冰箱中保存待用。

1.2方法

1.2.1生長(zhǎng)曲線的繪制挑取2環(huán)菌體于盛有100 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的三角瓶中（250 mL），于150 r/min、30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)36 h進(jìn)行活化。按2.5%（V/V）接種量分別將菌體接種于盛有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的三角瓶中，以無菌培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，每6 h取樣測(cè)定菌液D600 nm值，重復(fù)3次，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.2.2培養(yǎng)液的預(yù)處理按2.5%（V/V）接種量分別將菌體接種于盛有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的三角瓶中，振蕩培養(yǎng)條件同上。定時(shí)對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)段（遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期）的培養(yǎng)液進(jìn)行取樣，并于10 000 r/min、4 ℃下低溫冷凍離心10 min，收集上清液，用0.45 μm微孔過濾待用。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取混合酸儲(chǔ)備液依次稀釋2、10、20、100倍，得到乙酸濃度分別為5 000、2 500、500、250、50 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)混酸溶液，密封并于4 ℃冰箱保存待用。

1.2.4色譜條件美國(guó)Agilent 1260高效液相色譜儀，ZORBA SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為 205 nm；流動(dòng)相為pH值為2.45的3% CH3OH-0.05 mol/L Na2HPO4（V/V）緩沖溶液，流速為1.0 mL/min。

2結(jié)果與分析

2.1菌株莢膜染色

菌株020-18、021-3莢膜染色后于油鏡下觀測(cè)結(jié)果見圖1，可見2菌株菌體細(xì)胞周圍包裹了1層莢膜。endprint

2.2生長(zhǎng)曲線

由圖2、圖3可見，菌株020-18遲緩期并不明顯，6 h便已經(jīng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，20 h進(jìn)入穩(wěn)定期。菌株021-3具有明顯的遲緩期（0～10 h），12 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，20 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期。由于本試驗(yàn)以吸光度為表征依據(jù)，衰亡期雖多數(shù)菌體已死亡，但懸濁度仍然維持一定水平，故吸光度變化不大。最終確定菌株020-18生長(zhǎng)各時(shí)段培養(yǎng)時(shí)限分別為：遲緩期6 h、對(duì)數(shù)期18 h、穩(wěn)定期30 h、衰亡期72 h；菌株21-3生長(zhǎng)各時(shí)段培養(yǎng)時(shí)限分別為：遲緩期12 h對(duì)數(shù)期18 h、穩(wěn)定期24 h、衰亡期54 h。

2.3液相色譜條件的確定

2.3.1測(cè)定波長(zhǎng)及緩沖溶液的選取將標(biāo)準(zhǔn)混酸溶液進(jìn)樣后進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)205、210、215 nm處波長(zhǎng)對(duì)7種有機(jī)酸吸收均較好，選取分離效果最好的205 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。高效液相色譜測(cè)定有機(jī)酸試驗(yàn)多用磷酸鹽或甲醇/乙腈-磷酸鹽緩沖液體系進(jìn)行洗脫分離。磷酸鹽體系下各有機(jī)酸分離洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，但添加甲醇、乙腈后，不僅可以縮短各酸保留時(shí)間，還可以調(diào)整改善各有機(jī)酸峰型，減少拖尾。預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：3% CH3OH-0.05 mol/L Na2HPO4（V/V）緩沖體系在pH值為2.45條件下能較好地對(duì)各有機(jī)酸進(jìn)行分離。

2.3.2柱溫、流速有機(jī)酸在緩沖液中的解離程度隨著溫度的升高而增加，不利于有機(jī)酸的分離，較高的溫度也會(huì)使有機(jī)酸分離效果變差[12]，因此本試驗(yàn)選擇30 ℃作為分離柱溫，最終選擇流速為1 mL/min。

2.4有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜

在已確定的色譜條件下對(duì)7種混酸溶液進(jìn)行分離，色譜分離圖譜見圖4。

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)色譜圖上共出現(xiàn)8峰，可知從混合酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中共分離了8種物質(zhì)，除已知的7種有機(jī)酸外，必然存在1峰為雜質(zhì)峰。分別配置濃度均為5 mg/L的7種有機(jī)酸的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次進(jìn)樣分析，發(fā)現(xiàn)第7峰為雜質(zhì)峰。

2.5有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將稀釋倍數(shù)分別為100、20、10、2倍的標(biāo)準(zhǔn)混酸溶液依次進(jìn)樣，計(jì)算不同濃度下各有機(jī)酸的峰面積，并進(jìn)行線性回歸。由表1可知，各有機(jī)酸含量線性方程回歸良好。

表1各有機(jī)酸線性相關(guān)分析

有機(jī)酸1濃度范圍

（mg/L）1線性回歸方程1決定系數(shù)草酸15～5001y=7.575 1x+11.7691r2=0.999 8酒石酸150～5 0001y=0.918 4x+41.0031r2=0.999 8蘋果酸150～5 0001y=0.516 9x+23.9851r2=0.999 9乳酸150～5 0001y=0.394 2x-0.485 51r2=1.000 0乙酸150～5 0001y=0.334 7x+0.220 31r2=1.000 0檸檬酸150～5 0001y=0.613 4x+1.080 01r2=1.000 0琥珀酸150～5 0001y=0.351 1x-0.243 51r2=1.000 0

2.6菌株各時(shí)期的有機(jī)酸的測(cè)定

在已確定的色譜條件下對(duì)菌株020-18、021-3各生長(zhǎng)時(shí)期胞外發(fā)酵液中7種有機(jī)酸進(jìn)行色譜分離，其中020-18、021-3對(duì)數(shù)期分離結(jié)果見圖5、圖6。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基本身含有一定量的上述各有機(jī)酸，故考察菌株各生長(zhǎng)時(shí)期胞外有機(jī)酸代謝量時(shí)，需扣除培養(yǎng)基中各有機(jī)酸本底值，當(dāng)有機(jī)酸代謝量為負(fù)數(shù)時(shí)，表明菌株在生長(zhǎng)代謝過程中消耗了有機(jī)酸。

由表2可知，菌株020-18在生長(zhǎng)初期開始消耗草酸、乙酸，且需求量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增大；酒石酸、蘋果酸在菌體生長(zhǎng)初期有一定積累，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)不斷被消耗；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸含量呈現(xiàn)先增加后下降趨勢(shì)，在對(duì)數(shù)期達(dá)到最大值59.951 mg/L；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，檸檬酸含量呈現(xiàn)增加—下降—增加趨勢(shì)，在衰亡期達(dá)到最大值2 111.145 mg/L。

mg/L，衰亡期含量增加；菌體生長(zhǎng)初期，酒石酸含量達(dá)到最大值408.375 mg/L，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，含量呈先降低后升高趨勢(shì)；菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)蘋果酸的消耗較大，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，穩(wěn)定期蘋果酸含量達(dá)到最大值，隨后含量下降；隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，乳酸含量逐漸增大，54 h達(dá)到最大值2 412.68 mg/L；菌體生長(zhǎng)初期乙酸含量達(dá)到最大值1 695.052 mg/L，進(jìn)入對(duì)數(shù)期后含量陡然下降，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，衰亡期為 -2 678.12 mg/L。菌體整個(gè)生長(zhǎng)過程中檸檬酸、琥珀酸含量皆呈現(xiàn)先增加后下降趨勢(shì)，對(duì)數(shù)時(shí)期檸檬酸含量達(dá)最大值192.174 mg/L，琥珀酸在對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期含量相對(duì)穩(wěn)定。表3菌株021-3各生長(zhǎng)時(shí)期胞外有機(jī)酸代謝量

時(shí)間

（h）1有機(jī)酸代謝量（mg/L）草酸1酒石酸1蘋果酸1乳酸1乙酸1檸檬酸1琥珀酸12143.1001408.3751213.3661-31.66711 695.0521148.5521112.08818127.0671-43.0581-459.9851971.405145.2951192.17411 416.24524114.2221-359.06611 318.03912 368.2481-2 719.3301105.77611 306.00954140.0661-359.4461-161.31612 412.6801-2 678.1201-105.819172.461

3結(jié)論與討論

三羧酸循環(huán)（TCA）普遍存在于動(dòng)物、植物、微生物細(xì)胞中，不僅是機(jī)體在有氧條件下獲得能量的主要代謝途徑，其中間代謝產(chǎn)物更是合成某些重要有機(jī)物的必要前體物質(zhì)，如α-酮戊二酸、草酰胺酸分別為谷氨酸、天冬氨酸的前體。微生物生長(zhǎng)代謝過程中，利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在菌體細(xì)胞內(nèi)通過TCA等途徑不斷合成多種有機(jī)酸，當(dāng)積累到一定濃度時(shí)，胞內(nèi)外電化學(xué)梯度、滲透壓發(fā)生改變，有機(jī)酸通過跨膜運(yùn)輸?shù)确绞竭\(yùn)輸至胞外，并滯留于培養(yǎng)液中。最初培養(yǎng)基中碳源被分解利用形成丙酮酸，通過氧化脫羧方式生成乙酰CoA，并在線粒體中與起始底物草酰乙酸依次合成檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸等有機(jī)酸。在菌體生長(zhǎng)初期，菌株020-18不同程度地合成并分泌酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸等有機(jī)酸，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸等TCA循環(huán)中間產(chǎn)物連同其他代謝有機(jī)酸（草酸、乙酸、酒石酸）被不同程度消耗。這可能是由于菌株020-18菌體細(xì)胞較大、莢膜較厚，除了大量利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，通過各代謝途徑合成的有機(jī)酸隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗殆盡也被不同程度重新攝入細(xì)胞加以利用，以滿足機(jī)體生長(zhǎng)所需。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，檸檬酸含量陡然增高，這可能與菌株利用碳源的偏好性及后期細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境劇烈改變有關(guān)，菌株020-18可能更偏向利用琥珀酸、乙酸、酒石酸等有機(jī)酸，導(dǎo)致重新攝入的以及通過TCA途徑不斷合成的檸檬酸暫時(shí)積累于菌體細(xì)胞內(nèi)。隨著衰亡期的到來，菌體逐漸趨向凋亡，細(xì)胞內(nèi)外pH值、電化學(xué)梯度以及滲透壓等環(huán)境因素發(fā)生劇烈變化，使得檸檬酸最終被大量釋放到胞外培養(yǎng)液中。菌株021-3在整個(gè)生長(zhǎng)過程中均不同程度地代謝7種有機(jī)酸，由于生長(zhǎng)初期菌體繁殖量小，少量的檸檬酸、琥珀酸在菌體內(nèi)合成并分泌到胞外。隨著對(duì)數(shù)期的到來，大量乙酰CoA、草酰乙酸被消耗利用以合成ATP來維持菌體快速繁殖，導(dǎo)致經(jīng)由TCA生成的琥珀酸、檸檬酸含量不斷增加，隨著衰亡期的到來，培養(yǎng)液中琥珀酸、檸檬酸含量呈下降趨勢(shì)，這可能是由于菌體在衰亡期對(duì)檸檬酸、琥珀酸的合成減少，且二者作為菌株利用效能較高的碳源被重新攝入胞內(nèi)利用所致[12]。對(duì)數(shù)期蘋果酸被大量消耗，穩(wěn)定期、衰亡期蘋果酸含量變化趨勢(shì)同檸檬酸、琥珀酸相似。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸含量不斷增加，這同徐凱等的研究結(jié)果[13]一致。酒石酸含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加呈現(xiàn)先降低后增加趨勢(shì)，與檸檬酸代謝趨勢(shì)相反，這同楊文洲等的研究結(jié)果[14]類似。endprint

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