房保海等

摘 要：

建立了基于量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)的赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）雙抗夾心熒光免疫檢測(cè)（sandwich fluorescence-linked immunosorbent assay，sFLISA）體系，包含多克隆包被抗體、生物素標(biāo)記的多克隆檢測(cè)抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素等，獲得了sFLISA的最佳操作參數(shù)：包被抗體濃度2.5 μg/mL，檢測(cè)抗體稀釋500倍，量子點(diǎn)標(biāo)記鏈霉親和素稀釋100倍。該方法在OTA濃度3.125～125 μg/L之間時(shí)，相對(duì)熒光強(qiáng)度和OTA濃度呈線性關(guān)系，回歸方程為y=0.0206x+0.2018，R2=0.9924；加標(biāo)回收率在90.1%～110.0%之間，變異系數(shù)均小于10%，能較好地進(jìn)行赭曲霉毒素A的定量檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：赭曲霉毒素A（OTA）；量子點(diǎn)；雙抗夾心熒光免疫檢測(cè)（sFLISA）

中圖分類號(hào)：R155.5+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2014）04-0102-04

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是曲霉屬和青霉屬的某些菌種產(chǎn)生的次級(jí)代謝有毒產(chǎn)物，屬烈性的肝臟和腎臟毒素，并具有致癌、致畸和致突變性[1～3]。OTA廣泛存在于各種食物中，花生、谷物及其副產(chǎn)品是OTA 的主要來源，此外，在可可、咖啡、肉類、乳汁、干果、調(diào)味品、酒類中也存在OTA。這類毒素包括7種結(jié)構(gòu)類似的化合物，其中毒性最大、對(duì)農(nóng)作物污染最嚴(yán)重、分布最廣泛的是OTA，OTA被證實(shí)有致癌、致畸、致突變的作用，還具有免疫抑制性，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)LARC將OTA定位為2B類致癌物（即可能引起人類癌癥的物質(zhì)）[2，4] 。

OTA的產(chǎn)毒菌株廣泛地存在于自然界中，在谷類和人血清等樣品中都檢出過OTA殘留，嚴(yán)重危害人類的健康。由于OTA的危害性，各國都立法對(duì)食品中OTA的殘留進(jìn)行限定，至今已有多個(gè)國家制定了食品（1～50 μg/kg）和動(dòng)物飼料（100～1 000 μg/kg）的OTA限量標(biāo)準(zhǔn)。及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)和分析是預(yù)防和控制OTA危害的有效手段[5～7]。

量子點(diǎn)（Quantum dots，QDs） ，又稱無機(jī)半導(dǎo)體納米晶體，是一類由Ⅱ～Ⅵ 族（ 如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe 等） 或Ⅲ～Ⅴ 族（ 如InP、InAs 等） 元素組成的納米顆粒，是近年發(fā)展起來的一種新型熒光納米材料。與傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料相比，具有很多優(yōu)良的熒光性能，吸收光譜寬、發(fā)射光譜窄而對(duì)稱，斯托克斯位移（Stokes shift） 大及較高的熒光穩(wěn)定性和較長(zhǎng)的衰減壽命[8～11]。現(xiàn)在，量子點(diǎn)是最重要的納米材料之一，經(jīng)常被用作生物標(biāo)記及成像過程中的光學(xué)探針。

本研究利用多克隆抗體的強(qiáng)富集能力以及生物素-親和素系統(tǒng)的放大作用，以量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素為熒光探針，巧妙設(shè)計(jì)了一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的赭曲霉毒素A的雙抗夾心熒光免疫撿測(cè)（sFLISA）技術(shù)，為赭曲霉毒素A在食品安全等應(yīng)用領(lǐng)域提供技術(shù)基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

赭曲霉毒素A（中檢維康，50 μg/mL，1 mL）；兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗體（Global Biotech，250 μg/mL）；鼠抗赭曲霉毒素A抗體（生物素標(biāo)記，Covalab，1 mg/mL）；量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素-605（QS605，武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)開發(fā)有限公司）；96孔酶標(biāo)板（Thermofisher NUNC，黑色底透）。

1.2 主要儀器設(shè)備

多功能熒光酶標(biāo)儀（SpectraMax M5）；6930型冷凍離心機(jī)（日本KUBOTA公司）；MS3渦流旋轉(zhuǎn)振蕩儀（德國IKA公司）；Eppendorf移液槍（0～200、0～1 000 μL）；冰箱[冷藏溫度（4±1）℃]；恒溫培養(yǎng)箱[（37±1）℃]。

1.3 sFLISA方法步驟

1.3.1 抗體包被 用pH 9.6的0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液將兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗體稀釋成濃度為2.5 μg/L包被酶標(biāo)板，每孔100 μL。42℃孵育5 h，倒去包被液，用PBST洗3次，3 min/次，甩干。其中一孔不加包被抗體而加包被緩沖液，作為試劑空白。

1.3.2 封閉 用1× BSA-PBS溶液封閉板上的空白位點(diǎn)，每孔200 μL，37℃孵育1 h，倒去封閉液，用PBST洗3次，3 min/次，甩干。

1.3.3 加待檢樣品 除試劑空白及另留1排孔作為陰性對(duì)照外，其余各孔加待測(cè)樣品或倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品各100 μL，陰性對(duì)照孔加100 μL的1× BSA-PBS，37 ℃孵育1 h，用PBST洗3次，3 min/次，甩干。

1.3.4 加生物素化抗體 除試劑空白孔外，其余各孔加生物素化抗體100 μL，37℃孵育1 h，用PBST洗4次，3 min/次，甩干。

1.3.5 加量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素 所有各孔加100 μL用TBS緩沖液適當(dāng)稀釋的量子點(diǎn)標(biāo)記鏈霉親和素，37℃孵育10 min，用洗滌液PBST洗4次，3 min/次，甩干。

1.3.6 熒光檢測(cè) 在多功能熒光酶標(biāo)儀（SpectraMax M5）上390 nm激發(fā)波長(zhǎng)，605 nm發(fā)射波長(zhǎng)，選擇底讀模式，測(cè)量相對(duì)熒光強(qiáng)度（RFU，relative fluorescence units），減去試劑空白孔相對(duì)熒光強(qiáng)度，得到測(cè)量值。

1.4 檢測(cè)限和重現(xiàn)性

在3.125～125 μg/L濃度范圍內(nèi)，以P/N>2.1作為判定陽性的標(biāo)準(zhǔn)，得到檢測(cè)限。

選擇3個(gè)OTA濃度（6.25、25和50 μg/L），每個(gè)濃度反復(fù)測(cè)定4次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.5 方法的特異性分析endprint

在sFLISA 最佳工作條件下，分別檢測(cè)50 μg/L的黃曲霉毒素B1、BSA樣品，檢測(cè)抗體與被測(cè)物質(zhì)的交叉反應(yīng)程度。

1.6 加標(biāo)回收

不含OTA的1 g花生粉中加入不同量的OTA標(biāo)準(zhǔn)品（6.25、25、50 μg/L），密封，室溫過夜。次日按每管1 800 μL加入甲醇溶液（含0.01%乙酸）萃取1 h，10 000×g離心10 min后取上清液，加入等體積的PBS稀釋，取100 μL按照1.3進(jìn)行sFLISA測(cè)定，根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，推導(dǎo)出濃度值，計(jì)算添加回收率。

添加回收率（%）= 實(shí)測(cè)OTA含量/添加OTA含量×100

2 結(jié)果與分析

2.1 兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗體包被濃度的優(yōu)化

分別用濃度為0.5、1.25、2.5、5、10、20 mg/L的兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗體包被酶標(biāo)板，加入50 μg/L OTA標(biāo)準(zhǔn)品、1∶200稀釋的鼠抗赭曲霉毒素A多克隆抗體（生物素標(biāo)記）及1∶100稀釋的量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素，同等條件下進(jìn)行sFLISA，根據(jù)相對(duì)熒光強(qiáng)度值的變化選擇適合的包被濃度。結(jié)果（圖1）顯示，0.5～2.5 mg/L時(shí)相對(duì)熒光強(qiáng)度值呈遞增趨勢(shì)，>2.5 mg/L后則趨于飽和，故本試驗(yàn)確定兔抗OTA多克隆抗體最適包被濃度為2.5 mg/L。

圖1 兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗體包被濃度的優(yōu)化

2.2 鼠抗OTA多克隆抗體（生物素標(biāo)記）濃度的優(yōu)化

根據(jù)確定的一抗最適包被濃度包被酶標(biāo)板，加入50 μg/L的OTA標(biāo)準(zhǔn)品、不同稀釋倍數(shù)的鼠抗OTA多克隆抗體（生物素標(biāo)記）及1∶100稀釋的量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素，同等條件下進(jìn)行sFLISA，根據(jù)相對(duì)熒光強(qiáng)度值的變化選擇適合的第二抗體濃度。由圖2看出，相對(duì)熒光強(qiáng)度值在1∶500之后呈遞減趨勢(shì)，故本試驗(yàn)確定鼠抗OTA多克隆抗體（生物素標(biāo)記）適宜稀釋倍數(shù)為1∶500。

圖2 鼠抗OTA多克隆抗體（生物素標(biāo)記）濃度的優(yōu)化

2.3 量子點(diǎn)濃度的優(yōu)化選擇

根據(jù)確定的一抗最適包被濃度包被酶標(biāo)板，加入50 μg/L的OTA標(biāo)準(zhǔn)品、1∶500倍稀釋的鼠抗OTA多克隆抗體（生物素標(biāo)記）及不同稀釋倍數(shù)的量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素，同等條件下進(jìn)行sFLISA，根據(jù)相對(duì)熒光強(qiáng)度值的變化選擇適合的量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素。由圖3可以看出，在1∶100之后呈遞減趨勢(shì)，sFLISA的相對(duì)熒光強(qiáng)度呈遞減趨勢(shì)，故本試驗(yàn)確定使用量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素適宜稀釋倍數(shù)為1∶100。

圖3 量子點(diǎn)標(biāo)記鏈霉親和素濃度優(yōu)化

2.4 OTA sFLISA標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立

將OTA進(jìn)行梯度稀釋，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，采用以上雙抗體夾心FLISA法測(cè)定OTA。當(dāng)OTA的濃度在3.125～125 μg/L范圍時(shí)，OTA濃度與相對(duì)熒光強(qiáng)度之間呈線性關(guān)系（圖4a）；線性回歸方程為y=0.0206x+0.2018，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9924（圖4b）。在此濃度范圍內(nèi)，OTA濃度可進(jìn)行定量分析。

圖4 OTA濃度與相對(duì)熒光強(qiáng)度的關(guān)系

2.5 檢測(cè)限和重復(fù)性

在3.125～125 μg/L濃度范圍內(nèi)，以P/N>2.1作為判定陽性的標(biāo)準(zhǔn)，則OTA濃度的檢測(cè)限為3.125 μg/L。

選擇3個(gè)OTA濃度（6.25、25和50 μg/L），每個(gè)濃度反復(fù)測(cè)定4次。計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.63%、2.77%、5.65%；回收率分別為95.9%、100.6%、109.5%（表1），具有良好的重復(fù)性。

2.6 特異性試驗(yàn)

采用該sFLISA法檢測(cè)黃曲霉毒素B1和BSA時(shí)，測(cè)得的相對(duì)熒光強(qiáng)度平均值分別為0.080和0.070，與陰性值接近，且無顯著性差異。表明該法檢測(cè)赭曲霉毒素具有很好的特異性。

2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

通過加標(biāo)回收的測(cè)定結(jié)果（表2）可知 ，建立的sFLISA 能夠?qū)?個(gè)不同濃度的OTA進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，回收率范圍在90.1%～110.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。表明該方法可用于OTA的定量檢測(cè)。

3 結(jié)論

近年來，食品安全問題引起了全世界的普遍關(guān)注，尤其是毒素污染問題[12]。OTA在自然界中分布廣泛，是目前花生等油料作物污染較嚴(yán)重并且毒性最強(qiáng)的天然污染物之一。我國規(guī)定食品中赭曲霉毒素的含量（GB 2761-2011食品中真菌毒素限量）：谷物、豆類及其制品小于5.0 μg/kg；歐盟規(guī)定胡椒中的OTA殘留限量為15 μg/kg，辣椒中為30 μg/kg，小麥蛋白中為8.0 μg/kg。

本研究利用多克隆抗體的強(qiáng)富集能力以及生物素-親和素系統(tǒng)的放大作用，以量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素為熒光探針，建立了一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的基于量子點(diǎn)技術(shù)的OTA sFLISA方法，在3.125～125 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果較好，回收率范圍在90.1%～110.0%之間，變異系數(shù)均小于10%，能夠滿足我國和歐盟有關(guān)食品中OTA檢測(cè)限量要求，該方法具有分析時(shí)間短、不需要酶和顯色液、熒光性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可為OTA在食品安全等應(yīng)用領(lǐng)域提供技術(shù)基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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