李迎濤，姜寶華，閆路娜，邱 丹，王 莉

（1.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北政法職業(yè)學(xué)院 公共基礎(chǔ)部，河北 石家莊 050061）

蜂毒肽抗腫瘤機(jī)制及臨床應(yīng)用進(jìn)展

李迎濤1，姜寶華2，閆路娜1，邱 丹1，王 莉1

（1.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北政法職業(yè)學(xué)院 公共基礎(chǔ)部，河北 石家莊 050061）

蜂毒肽（Melittin，MLT）是蜂毒的主要成分，在蜂毒中含量最高，大約為蜂毒干重的50%，是蜂毒生物活性的主要載體。蜂毒肽作為一種重要的抗菌肽具有抗菌消炎、鎮(zhèn)痛、抗輻射、抑制血小板凝集、抗艾滋病病毒等多種藥理學(xué)作用。目前，蜂毒肽已成為抗腫瘤新藥中的研究熱點(diǎn)。本文綜述了最新的蜂毒肽抗腫瘤機(jī)制及其應(yīng)用，若將各種蜂毒制劑聯(lián)合化療，具有減毒增效的作用，在臨床上具有很好的療效，其潛在的藥用價(jià)值日益引起人們的重視。

腫瘤；蜂毒肽；凋亡；調(diào)控機(jī)制

蜂毒是一種成分復(fù)雜的混合物，主要含蛋白質(zhì)、肽類、生物胺和其他小分子有機(jī)物。蛋白質(zhì)類主要有透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase）和磷脂酶A2（phospholipase，PLA2）；肽類主要有蜂毒溶血肽（又稱蜂毒肽，melittin）、蜂毒明肽（apamin）和肥大細(xì)胞脫粒肽（mast cell degranulating peptide，MCD肽）；生物胺主要有組胺、多巴胺、去甲腎上腺素和氨基丁酸；小分子有機(jī)物主要有糖類、磷脂類、氨基酸類、膽堿、甘油和揮發(fā)性化合物（一種信息素）。蜂毒溶血肽（Melittin，MLT）占蜂毒的40%以上，是蜂毒發(fā)揮藥理作用和生物活性的主要成分。其作為一種重要的抗菌肽具有抗菌消炎、鎮(zhèn)痛、抗輻射、抑制血小板凝集、抗艾滋病病毒等多種藥理學(xué)作用。國外類似的制劑有英國BVV藥廠的Melittin，蘇聯(lián)的Aplite。這些制劑已除去了蜂毒中引起過敏的高分子量組份——透明質(zhì)酸酶及磷醋酶A2。蜂毒肽具有很強(qiáng)的表面活性，直接破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，造成細(xì)胞的裂解致死。所以理論上講蜂毒肽具有廣譜性和速效性殺菌的優(yōu)良特性。與抗生素相比，蜂毒抗菌肽具有抗菌譜廣、低濃度下也可發(fā)揮作用、不易使微生物產(chǎn)生耐藥性以及可以合成不同于天然肽的類似物等優(yōu)勢(shì)。

一、蜂毒肽的分子基礎(chǔ)及構(gòu)效關(guān)系

蜂毒肽是由26個(gè)氨基酸組成的兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)，是一種線性肽，有四個(gè)二硫鍵連接，其相對(duì)分子量為2849（前體分子量7Kd），氨基酸的排列順序?yàn)椋焊?異亮-甘-丙-纈-亮-賴-纈-亮-蘇-蘇-甘-亮-脯-丙-亮-異亮-絲-色-異亮-賴-精-賴-精-谷-谷。蜂毒肽的N末端起前20個(gè)氨基酸殘基主要是疏水的，而C末端的6個(gè)氨基酸殘基主要是親水的。在通常情況下，C-末端有4個(gè)氨基酸殘基攜帶正電荷，N-末端有2個(gè)氨基酸殘基攜帶正電荷，整個(gè)分子帶6個(gè)正電荷。分子中三個(gè)賴氨酸和二個(gè)精氨酸殘基的存在使蜂毒溶血肽成為強(qiáng)堿性肽，在中性水溶液中，其作為單體是以隨機(jī)的卷曲結(jié)構(gòu)存在的。蜂毒肽可以自我交聯(lián)，形成a螺旋的四聚體結(jié)構(gòu)。蜂毒肽的兩親性是膜結(jié)合肽和膜蛋白跨膜螺旋的特征，所以這個(gè)特性決定它既可以溶于水，又可以與膜自然結(jié)合，進(jìn)而溶解細(xì)胞。蜂毒肽是種低分子量組份，其分子N端的疏水基團(tuán)與細(xì)胞膜磷脂的結(jié)合、溶解了細(xì)胞膜，起到了細(xì)胞毒素作用。有學(xué)者研究證實(shí)，蜂毒肽在高濃度時(shí)，形成四聚體狀態(tài)，能夠比單體更有效的與細(xì)胞膜結(jié)合，形成了離子通道從而改變了細(xì)胞膜的通透性，引起Ca2+內(nèi)流，通過升高胞內(nèi)Ca2+濃度使細(xì)胞裂解，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。蜂毒肽的分子小，比起蓖麻毒素或喉毒蛋白等分子量較大的毒素，免疫原性低且不易產(chǎn)生過敏反應(yīng)。對(duì)正常胞的毒性較低所以可較大劑量使用。蜂毒肽是迄今為止人類所知抗炎活性最強(qiáng)的物質(zhì)之一，它能夠抗菌抗病毒，可以抑制20多種革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌的生長繁殖。除此之外，蜂毒肽還具有良好的抗腫瘤作用。它可以與其他抗菌肽組成雜交肽分子，使抗腫瘤作用明顯加強(qiáng)。探討蜂毒肽抑制腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)理，對(duì)腫瘤的臨床治療具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。

二、蜂毒肽抗腫瘤作用的機(jī)制

1.直接將腫瘤細(xì)胞殺傷。①在細(xì)胞上直接形成孔隙溶解細(xì)胞。蜂毒肽等裂解肽，可以在細(xì)胞膜上形成孔隙，其機(jī)制與結(jié)合到膜表面和插入膜的結(jié)合肽的閥值水平有關(guān)。分析表明，蜂毒肽在兩性脂膜上不僅形成孔隙，也抑制孔隙的形成，這是兩個(gè)模式競爭反應(yīng)的結(jié)果：直接插入到膜里面和平行結(jié)合到膜表面。蜂毒肽可以在毫秒之內(nèi)結(jié)合到脂膜上，采用α-螺旋結(jié)構(gòu)，垂直或平行結(jié)合到膜平面。蜂毒肽的直接插入會(huì)導(dǎo)致孔隙的形成，然而平行結(jié)合的蜂毒肽卻無效，并且平行結(jié)合的蜂毒肽還會(huì)阻止其他蜂毒肽的插入，從而防止形成孔隙。這些觀察結(jié)果引出了孔隙形成兩步模式的觀點(diǎn)：低濃度的蜂毒肽平行結(jié)合到膜上，濃度升高時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)榇怪睒?gòu)像，導(dǎo)致孔隙的形成。目前對(duì)從平行到垂直構(gòu)象的轉(zhuǎn)變還缺乏了解，主要因?yàn)殛栯x子蜂毒肽（pH=5）與脂質(zhì)的作用強(qiáng)烈（磷脂酰膽堿的分配系數(shù)為104～105mol/L），并且從平行轉(zhuǎn)換到垂直時(shí)所需能量時(shí)非常大?；诜涠倦膶?duì)磷脂酰膽堿基團(tuán)的高強(qiáng)親和力，人們普遍認(rèn)為形成孔隙所需要的蜂毒肽濃度不是蜂毒肽的絕對(duì)濃度，而是相對(duì)濃度。然而，還沒有直接通過改脂質(zhì)的濃度和確定結(jié)合程度或自由蜂毒肽片段的方法測(cè)驗(yàn)過。蜂毒肽潛在藥用價(jià)值引起了科學(xué)家的很大興趣，在所有裂解肽中，26個(gè)氨基酸殘基的蜂毒肽是目前研究最好的。②激活腫瘤細(xì)胞上的磷脂酶從而使細(xì)胞死亡。蜂毒肽可以根據(jù)膜濃度的比例，抑制或激活磷脂酶的活性。低濃度的蜂毒肽抑制PLA2，當(dāng)濃度≥1μmol/L時(shí)，則激活PLA2。通過在人血清中蜂毒肽降解大腸桿菌釋放脂肪酸的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血清中存在一種對(duì)熱和胰島素敏感的因子，這種因子對(duì)蜂毒肽激活磷脂酶的過程有促進(jìn)作用，同時(shí)也可激活磷脂酶D。蜂毒肽與腫瘤細(xì)胞作用后，降解掉腫瘤細(xì)胞膜上的Band-2蛋白的一個(gè)亞型。Band-3蛋白被降解為兩部分。Band-3蛋白是構(gòu)成腫瘤細(xì)胞膜跨膜蛋白的主要組成部分，Band-3蛋白不但構(gòu)成細(xì)胞膜上的離子通道，還具有抗菌抗病毒以及防止蛋白水解酶水解膜蛋白的作用。Band-3蛋白水解后，離子無法進(jìn)出細(xì)胞膜從而導(dǎo)致細(xì)胞代謝功能的失調(diào)，細(xì)胞的正常生命活動(dòng)受阻，從而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。由于膜保護(hù)劑被破壞，肽分子間接激活了膜上或環(huán)境中的蛋白酶，并與Band-2結(jié)合，使磷酸化作用和Ca2+-ATP酶活性受到抑制，且影響B(tài)and-2蛋白的膜收縮作用和膜骨架功能，從而導(dǎo)致整個(gè)膜的功能失常。

2.誘導(dǎo)細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序。許多化學(xué)藥物可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序使細(xì)胞自動(dòng)凋亡，從而達(dá)到抗腫瘤的目的。能否誘導(dǎo)細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序是篩選抗癌藥物的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。有實(shí)驗(yàn)顯示，蜂毒肽在體外能夠抑制人胃癌細(xì)胞株SCG-7901，可以將胃癌細(xì)胞阻滯在G2/M期，同時(shí)誘導(dǎo)癌細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序。有人通過建立人肝癌裸鼠移植瘤模型進(jìn)一步探討蜂毒肽的體外抗腫瘤作用。認(rèn)為，蜂毒肽對(duì)提高移植瘤的抑制率具有顯著作用，移植瘤的體積與藥用時(shí)間的長短，有要的劑量的多少呈正相關(guān)。細(xì)胞凋亡是調(diào)節(jié)腫瘤生長的一個(gè)重要因素，腫瘤之所以產(chǎn)生，是細(xì)胞分化、增殖、凋亡異常的結(jié)果。蜂毒肽對(duì)肝臟腫瘤細(xì)胞Hep-2裸鼠皮下移植瘤的生長具有強(qiáng)烈的抑制作用，可以極大的增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，因此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序可能是蜂毒肽抗腫瘤的機(jī)制之一。蜂毒肽能夠激活磷脂酶A2，激活的磷脂酶A2能夠使線粒體膜和溶酶體膜喪失穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致線粒體和溶酶體破裂繼而將細(xì)胞殺死。蜂毒肽還可以將線粒體膜內(nèi)的結(jié)合蛋白質(zhì)釋放出來，這一步在早期引起細(xì)胞凋亡的眾多途徑中是關(guān)鍵一步。蜂毒肽還可以強(qiáng)烈抑制鈉鉀泵的功能，使細(xì)胞喪失正常的膜電位，導(dǎo)致細(xì)胞膜功能失常。AFP促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的重要的內(nèi)源性物質(zhì)之一，然而它卻抑制免疫細(xì)胞的DNA合成和細(xì)胞的分裂。有實(shí)驗(yàn)證明，AFP與蜂毒肽起拮抗作用，起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。種種研究結(jié)果表明AFP基因的異常表達(dá)是維持肝癌細(xì)胞惡性生長的分子基礎(chǔ)，利用AFP轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列驅(qū)動(dòng)治療基因表達(dá)是肝癌靶向基因治療的主要方法之一。

3.影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)經(jīng)過一系列多步驟、復(fù)雜的相互作用就可能形成惡性腫瘤的侵襲。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移也與粘附分子有關(guān)。在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的整個(gè)過程都伴有細(xì)胞的脫落與聚合、粘附與去粘附。有研究顯示蜂毒肽基因轉(zhuǎn)染可以抑制CD54分子的表達(dá)，通過改變腫瘤的生物學(xué)行為達(dá)到抗腫瘤的效果。另有研究顯示蜂毒肽預(yù)防肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移可能與其抑制Rac1信號(hào)通路有關(guān)。有研究利用腺病毒作為載體將蜂毒肽基因?qū)敫闻K腫瘤細(xì)胞后整合到肝癌細(xì)胞的基因組，使肝癌細(xì)胞的生長明顯受到抑制。因?yàn)槿鄙俜涠倦目贵w，還不能從蛋白質(zhì)水平確定蜂毒肽基因的表達(dá)。但是病毒Ad-rAFP-Mel顯著抑制HepG2細(xì)胞生長，且有量效關(guān)系。

4.改變腫瘤的生存環(huán)境。原發(fā)性腫瘤若想在機(jī)體內(nèi)生長和繁殖，必須要在于案發(fā)地組織周圍形成新的血管，供給營養(yǎng)物質(zhì)，并且這些血管也為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了有利條件。下調(diào)VEGF和β-FGF的表達(dá)，抑制腫瘤周圍血管的生成可能會(huì)成為抗腫瘤的一種手段。有學(xué)者觀察了蜂毒肽對(duì)骨肉瘤UNR-106細(xì)胞裸鼠移植瘤的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蜂毒肽治療組的新生血管數(shù)量明顯少于對(duì)照組，說明蜂毒肽能夠抑制新生血管的形成。同時(shí)還有研究發(fā)現(xiàn)蜂毒肽對(duì)雞胚絨毛尿囊膜的血管形成也有明顯的抑制作用。因而有學(xué)者提出蜂毒肽對(duì)腫瘤的抑制作用可能與改變了腫瘤的生長環(huán)境有關(guān)——抑制周圍血管的生成，是腫瘤細(xì)胞由于缺乏營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)而死亡，并且可以降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

三、蜂毒肽抗腫瘤的臨床應(yīng)用

1.組成雜合肽。蜂毒肽與天然抗菌肽形成的雜合肽不但具有很強(qiáng)的抗菌作用，而且在抗腫瘤方面也有很好的療效。有學(xué)者利用肺癌細(xì)胞系對(duì)雜合肽的結(jié)構(gòu)同抗菌作用和抗腫瘤的效果的關(guān)系進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肽的18和19位殘基均是堿性的K，16位殘基是疏水的L或V時(shí)，抗腫瘤作用更強(qiáng)；第12位殘基與溶血作用有關(guān)而與抗腫瘤作用無關(guān)；第4位的P使堿性程度增加從而增強(qiáng)了溶血作用，但抗腫瘤作用無明顯改變。

2.將蜂毒肽制成免疫毒素。在免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用的過程中，T淋巴細(xì)胞執(zhí)行特異性細(xì)胞免疫的功能。由于殺傷性T細(xì)胞核抑制性體細(xì)胞的抗原決定簇相同，遲發(fā)型過敏發(fā)應(yīng)T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞稱為CD4，Th細(xì)胞和Tdth細(xì)胞稱為CD8，通過測(cè)量經(jīng)蜂毒肽治療后的CD4和CD8的變化，可以測(cè)量出蜂毒肽分子對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的影響。在一定程度上T細(xì)胞亞群可以作為免疫系統(tǒng)平衡標(biāo)志的，CD4/CD8的比值在免疫學(xué)上常用來衡量免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定程度。蜂毒肽與T淋巴細(xì)胞亞群的作用是雙向的，無論向哪個(gè)方向偏離，都會(huì)有回歸正常范圍的趨勢(shì)。利用蜂毒肽治療時(shí)，CD4細(xì)胞數(shù)量要比CD8細(xì)胞升高的早，但是經(jīng)過一段時(shí)間的調(diào)整后，兩者又恢復(fù)平衡狀態(tài)，但是這種短暫地失衡對(duì)患者的影響不大。一直以來，蜂毒肽被認(rèn)為是理想的免疫調(diào)節(jié)藥物。但從療效來看，CD4和CD8的變化范圍越大，治療的效果越顯著。蜂毒肽對(duì)CD4/CD8影響，就是蜂毒肽雙向免疫調(diào)節(jié)作用的證明。利用單克隆抗體的特異性，將蜂毒肽帶到病灶以殺傷腫瘤細(xì)胞。將蜂毒肽分子與單克隆抗體通過化學(xué)鍵連接到一起，這樣組成的偶聯(lián)物既可以保留單克隆抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別，又保留了蜂毒肽對(duì)腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)烈的殺傷作用，降低了蜂毒肽對(duì)正常機(jī)體細(xì)胞的破壞力。將編碼蜂毒肽的基因片段和編碼抗體的基因片段構(gòu)建成復(fù)合基因，然后將構(gòu)建的符合基因?qū)氪竽c桿菌并整合到其基因組內(nèi)予以表達(dá)。表達(dá)的產(chǎn)物克服了蜂毒肽對(duì)機(jī)體的非特異性殺傷，又可以借助單克隆抗體的精確定位作用大大提高蜂毒肽對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力。有人通過化學(xué)合成的方法合成蜂毒肽，去掉了蜂毒肽C端的4個(gè)氨基酸，使其能夠形成α-螺旋結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)其水溶性，提高其溶血能力。

3.蜂毒肽類似物的研究。把天然蜂毒肽基因整合到pGEX-4T-2載體中，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pDEX-AccM的BL21。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物蛋白占工程菌蛋白的15.2%，并且具有水溶性的占40%，蛋白的純化提取均很方便。蜂毒肽基因雖為真核基因，但是由于其結(jié)構(gòu)簡單，含脫氧核苷酸的數(shù)目少，翻譯的產(chǎn)物不用糖基化等修飾，在原核生物中表達(dá)的產(chǎn)物也具有很高的活性。

4.蜂毒肽基因直接導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞內(nèi)。我們可以將蜂毒肽基因直接導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，讓其表達(dá)的產(chǎn)物持續(xù)不斷的對(duì)病灶給藥，以達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的作用。有人將蜂毒肽基因整合到腺病毒的基因組上，然后讓重組的腺病毒侵染肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抑制肝臟腫瘤的效果明顯。

四、蜂毒肽作為抗腫瘤藥物存在的問題及解決的方法

蜂毒的成分十分復(fù)雜，各成分作用也不一樣，如若使用不當(dāng)，可引起過敏性水腫、過敏性休克等副作用。人工合成蜂毒肽單體的工藝煩瑣，成本太高。因此提純蜂毒肽的研究意義重大。傳統(tǒng)提取蜂毒肽的方法是采用凝膠柱色譜加離子交換柱進(jìn)行梯度洗脫，制得的蜂毒素組分中常含有磷脂酶A2等雜質(zhì)，且梯度洗脫操作較煩瑣?，F(xiàn)代工藝選用單一流動(dòng)相，采用多種規(guī)格的分離凝膠柱分3步進(jìn)行分離純化，這種工藝的洗脫速度適中，純化過程較為省時(shí)，利用高效液相色譜對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，這種工藝較之傳統(tǒng)工藝分離所得到的蜂毒素的純度更高。由于蜂毒肽毒性較大，當(dāng)用量過大時(shí)會(huì)對(duì)正常的機(jī)體組織造成一定的傷害，尤其是蜂毒肽的溶血作用，使用不當(dāng)可能造成嚴(yán)重后果。這些不利因素限制的蜂毒肽的在臨床應(yīng)用上的推廣。為了消除蜂毒肽的這些弊端，達(dá)到增效減毒的目的，有人將蜂毒肽溶于泊洛沙姆407中制成緩釋劑。這種方法制成的緩釋劑經(jīng)試驗(yàn)證明其毒性明顯低于單純的蜂毒肽，經(jīng)緩蝕劑處理過的腫瘤細(xì)胞的生長受到明顯的抑制，腫瘤組織廣泛壞死，處理后的腫瘤組織平均生存期延長，綜合治療作用優(yōu)于單純的蜂毒肽。這表明蜂毒肽緩蝕劑延長了蜂毒肽的作用時(shí)間，增強(qiáng)了蜂毒肽的抗腫瘤效果，并且單位時(shí)間內(nèi)作用于機(jī)體的藥量減少，降低了蜂毒肽對(duì)機(jī)體正常組織的毒害作用。除此之外，有人采用將蜂毒肽制備成蜂毒肽-聚乳酸羥乙酸微球，然后將其導(dǎo)入大鼠移植性肝癌部位，藥物在腫瘤部位局部緩慢釋放，使病灶部位的藥物濃度高，但全身濃度卻相對(duì)較低，這樣不但增強(qiáng)了藥物的對(duì)腫瘤的殺傷力，也起到了減毒的作用，效果明顯優(yōu)于單純的蜂毒肽。

[1]李紹祥，凌昌全，劉新垣.攜蜂毒素基因腺病毒感染對(duì)HepG2細(xì)胞CD54表達(dá)的影響[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，23（4）：300.

[2]劉嶺，凌昌全，黃雪強(qiáng).蜂毒素的純化方法及體外抗腫瘤作用研究[J].中國生化藥物雜志，2003，24（4）：163-166.

R979.1

A

1674-9324（2014）29-0140-03

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（C2012208069）；河北科技大學(xué)創(chuàng)新基金資助課題。

李迎濤，碩士研究生，研究方向：分子藥理學(xué)。

王莉，博士，副教授，研究方向：分子藥理學(xué)。