楊倩，蔣陽(yáng)月，王小軍，陳英文，沈樹(shù)寶，石利利，劉濟(jì)寧

（1南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京210009；2環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇 南京210042）

活性污泥法處理廢水是用生物法處理廢水的最主要方法?；钚晕勰嗍翘幚韽U水的核心，主要包括各種類(lèi)型的微生物，如細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌、后生動(dòng)物、病毒和藻類(lèi)等，其中細(xì)菌約占總微生物種群的95%，并在廢水處理過(guò)程中起到關(guān)鍵作用[1]。對(duì)活性污泥中微生物菌群的研究能夠從微觀上分析活性污泥處理廢水的機(jī)理，并且可以有效分析污水處理廠運(yùn)行過(guò)程中出現(xiàn)的諸多問(wèn)題，如污泥膨脹[2-3]等。因此，活性污泥的微生物群落分析是生物法處理廢水的研究重點(diǎn)。在20 世紀(jì)80年代之前主要以傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法為主，如顯微鏡觀察微生物形態(tài)、純種分離純化、菌落計(jì)數(shù)等[4-8]，但是培養(yǎng)基選擇的不同會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)微生物的差異，并且環(huán)境中的很多細(xì)菌很難通過(guò)培養(yǎng)而得到[9]，因此嚴(yán)重影響對(duì)菌群結(jié)構(gòu)的分析。另外有研究表明，活性污泥中只有1%～15%的微生物為可培養(yǎng)微生物[10]，因此傳統(tǒng)培養(yǎng)法只能獲悉活性污泥的部分信息。隨著生物分子學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于16S rRNA 為主要基石的聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)、克隆文庫(kù)技術(shù)、熒光原位雜交（FISH）等免培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)逐步應(yīng)用于環(huán)境微生物的分析中[11-15]。其中聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）法能夠避免傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)的缺陷，且操作簡(jiǎn)單快捷，廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物多樣性檢驗(yàn)和動(dòng)態(tài)分析中[16-21]。不少研究者用PCR-DGGE 法分析了不同運(yùn)行工藝或不同處理對(duì)象的活性污泥之間的差異性，如Abd 等[22]分析了兩種不同運(yùn)行工藝的活性污泥的微生物群落組成及動(dòng)態(tài)變化，Nico Boon 等[23]比較了處理不同產(chǎn)業(yè)廢水的活性污泥的菌群差異性，但是對(duì)于不同區(qū)域活性污泥的差異性報(bào)道卻很少。

中國(guó)地大物博，南北跨度較大，不同區(qū)域的自然環(huán)境和人文經(jīng)濟(jì)情況也相差巨大。本工作結(jié)合純種分離純化和變性梯度凝膠電泳法等手段，對(duì)中國(guó)從南方至北方不同區(qū)域的污水處理廠的活性污泥中的細(xì)菌群落特征和多樣性進(jìn)行分析，揭示其地域差異性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源及試劑

活性污泥樣品分別采集自廣州、南京、沈陽(yáng)地區(qū)的市政污水處理廠的曝氣池末端，各污水處理廠的運(yùn)行工藝和取樣時(shí)間見(jiàn)表1。所有樣品用無(wú)菌采樣袋盛裝并放入冰盒內(nèi)保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，樣品保存在-20℃用于DNA 提取。

細(xì)菌的培養(yǎng)用LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基，其成分為：胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，氯化鈉10.0g，瓊脂粉20.0g，蒸餾水1000mL，pH 值7.2。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目和方法

1.2.1 活性污泥可培養(yǎng)微細(xì)菌數(shù)量

采用稀釋平板法測(cè)定活性污泥中細(xì)菌的數(shù)量，按照GB 4789.2—1994 《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》和SN 0168—92《中華人民共和國(guó)進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 出口食品菌落計(jì)數(shù)》進(jìn)行菌落數(shù)測(cè)定。

表1 各城市污水處理廠基本情況

1.2.2 活性污泥可培養(yǎng)細(xì)菌鑒定

在上述LB 培養(yǎng)基上，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等特征的差異性挑出不同的可培養(yǎng)細(xì)菌，每一種菌分別挑取少量，重新在平板培養(yǎng)基上進(jìn)行三區(qū)劃線(xiàn)分離，將平板倒置在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌株長(zhǎng)好后，檢查其特征是否一致，同時(shí)將細(xì)胞涂片染色后用顯微鏡檢查是否為單一的微生物細(xì)胞。若有雜菌，須再次進(jìn)行分離純化，直到獲得純培養(yǎng)，然后采用16S rRNA 基因序列分析技術(shù)進(jìn)行鑒定。16S rDNA 片段的擴(kuò)增，采用引物27F（5’-AACTGAAGAGTTTGATCCTGGCTC-3’）和1492R（5’-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3’）。PCR 擴(kuò)增體系為25μL，2×Master Mix 12.5μL，上下游引物各1μL(10μmol/L)，DNA 模板1μL(15ng)，無(wú)菌超純水9.5μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2min，95℃變性1min，55℃退火1.5min，72℃延伸2min，共29 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，送去南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 活性污泥DNA 提取及PCR 擴(kuò)增和變性梯度凝膠電泳

活性污泥樣品經(jīng)離心后，沉淀部分使用UltraClean TM Soil DNA Isolation 試劑盒（Mo BIO Laboratories）提取DNA，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

DNA 的PCR 擴(kuò)增體系均為50μL 體系：10×PCR緩沖液5μL，MgCl23.5μL(20mmol/L)，dNTP 2μL(10mmol/L) ， 上 下 游 引 物 518R(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’) 和 GC338F(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGG CACGGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGC-3’)各1μL(10μmol/L)，Taq DNA 聚合酶（REGEN BIOTEC公司）0.3μL(1.5U)，DNA 模板1μL(15ng)，無(wú)菌超純水36μL。PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)。變性梯度凝膠電泳（DGGE）采用CBS-DGGE 電泳系統(tǒng)（CBS Scientific Co.），聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，變性梯度從35%至65%（100%的變性劑溶液含7mol/L 的尿素和40%甲酰胺）。電泳緩沖液為1×TAE，PCR 產(chǎn)物上樣量為500ng，60℃，100V電泳12h，EB 染色20min，UVP 凝膠影像分析系統(tǒng)拍照[24]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

活性污泥中可培養(yǎng)細(xì)菌經(jīng)測(cè)序后，測(cè)得的16S rDNA 序列在美國(guó)生物技術(shù)信息中心（NCBI）核酸數(shù)據(jù)庫(kù)（Genbank）中進(jìn)行Blast 搜索比對(duì)。采用Clustal X、BioEdit 和Mega 4.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

DGGE 指紋圖譜使用Gelcompar Ⅱ 軟件分析[25]。其中，聚類(lèi)分析使用UPGMA（unweighted pair-group method with arithmetic averages）方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 活性污泥的基本參數(shù)和細(xì)菌總數(shù)

所取樣品的污泥沉降比（SV30）、懸浮物濃度（MLSS）、污泥體積指數(shù)（SVI）以及細(xì)菌總數(shù)見(jiàn)表2。除了CD 的SVI 值稍微偏高外，大部分活性污泥的SVI 值均在50～120 之間，表明這些污泥的性能均良好，CD 可能是有輕微的污泥膨脹現(xiàn)象發(fā)生。菌落計(jì)數(shù)的樣品是從曝氣池取得的未經(jīng)沉淀的活性污泥。廣州和沈陽(yáng)地區(qū)的樣品在采樣后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室的時(shí)間較長(zhǎng)，在保存過(guò)程中部分細(xì)菌的活性喪失，可能是這兩個(gè)地區(qū)的菌落數(shù)與南京地區(qū)相差一個(gè)數(shù)量級(jí)的原因。另外污水處理廠的處理工藝和污泥的泥齡可能也會(huì)影響細(xì)菌數(shù)。

表2 活性污泥的基本參數(shù)

2.2 可培養(yǎng)細(xì)菌的菌種鑒定

根據(jù)菌落形態(tài)和顏色的差異性，南京地區(qū)CD、CB、JXZ、JN 分別分離出10、12、10 和11 種菌；廣州地區(qū)DTS、LD 和LR 分別分離出9、11、和8種菌；沈陽(yáng)地區(qū)SSW 和XNH 各得到9 種菌，共89種細(xì)菌。將測(cè)得的細(xì)菌16S rDAN 序列在NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast 比對(duì)，獲得各條序列的同源性信息。

比對(duì)結(jié)果顯示所測(cè)的序列與Blast 數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列均具有較高的相似性，均在96%以上，因此可以確定這些細(xì)菌的菌屬[26]。大部分活性污泥中均包含假單胞菌（Pseudomonas）、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）、芽孢桿菌（Bacillus）、氣單胞菌（Aeromonas）、克雷伯氏菌（Klebsiella）等，這些都是活性污泥中常見(jiàn)的細(xì)菌[27]。

將所測(cè)得的目的序列與對(duì)應(yīng)的親緣關(guān)系最近的已鑒別出的微生物進(jìn)行多序列比對(duì)后，結(jié)合Clustalx和Mega 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以顯示所分離出的菌種與已知菌種直接的親緣關(guān)系。圖1 是3 個(gè)地區(qū)分離的可培養(yǎng)細(xì)菌的序列與親緣種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。對(duì)所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行劃群分析，發(fā)現(xiàn)每個(gè)污水處理廠的活性污泥中的細(xì)菌都主要屬于厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria），包括β-變形菌門(mén)（Bataproteobacteria）和γ-變形菌門(mén)（Gamaproteobacteria），這也跟之前的文獻(xiàn)研究結(jié)果相一致[28]。其中，厚壁菌門(mén)主要以芽孢桿菌為主，另外含有少量的微桿菌和葡萄球菌。芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶和淀粉酶等酶能夠分解污水中的有機(jī)大分子，產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)某些致病菌具有抑殺作用[29]，另外芽孢桿菌還具有促硝化作用[30]，能夠降解廢水中的氨氮，因此具有較好的污水凈化能力。β-變形菌門(mén)所占變形菌門(mén)的比例相對(duì)較少，主要以奈瑟菌目和伯克氏菌目為主。γ-變形菌門(mén)在活性污泥中屬于優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，活性污泥中常見(jiàn)的假單胞菌、腸桿菌、氣單胞菌等都屬于γ-變形菌門(mén)。南京地區(qū)還分離出了幾種放線(xiàn)菌（Actinobacteria），包括鏈霉菌（Streptomycetaceae）和微球菌（Micrococcaceae）等，尤其是CD 的活性污泥中分離的放線(xiàn)菌較多，這應(yīng)該是CD 的SVI 值偏高的主要原因。

圖1 活性污泥中可培養(yǎng)細(xì)菌的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 活性污泥的DGGE 分析

圖2 16S rDNA V3 片段PCR 產(chǎn)物的DGGE 圖譜

從圖2 的DGGE 圖譜中可以看出，不同活性污泥樣品的電泳圖譜在條帶的數(shù)量、位置以及亮度上都存在一些差異，如1 號(hào)條帶在XNH 中較亮，20 號(hào)條帶在DTS 中比較亮，29 號(hào)條帶在CD 中較亮，35 號(hào)條帶在CB 中較亮，而這些條帶在其他樣品中均比較弱甚至未出現(xiàn)，說(shuō)明各樣品中具有不同的菌落結(jié)構(gòu)，因?yàn)檫\(yùn)行工藝、進(jìn)水水質(zhì)如BOD、COD 等的差異以及pH 值、溫度、曝氣時(shí)間等各種因素的不同均會(huì)導(dǎo)致活性污泥的組成變化。但是所有活性污泥樣品中的菌種豐富度都非常高，不同的樣品中存在很多相同的條帶，如條帶4、5、6、7、9、10，說(shuō)明活性污泥中大部分微生物的種類(lèi)是比較固定的，是屬于所有活性污泥中共有的優(yōu)勢(shì)菌群，其中6、7 條帶在大部分泳道中都比較亮，說(shuō)明這兩種菌在活性污泥中的含量很高，在污水處理過(guò)程中起到關(guān)鍵的作用。

從樣品的相似性矩陣圖（表4）可知，南京地區(qū)，城北（CB）和江心洲（JXZ）的相似性最高，達(dá)到81.34%，江寧（JN）和江心洲的相似性最低，只有58.35%；廣州地區(qū)獵德（LD）和瀝溶（LR）的相似性最高，為85.47%，瀝溶和大坦沙（DTS）的相似性最低，也達(dá)到75.77%，沈陽(yáng)地區(qū)沈水灣（SSW）和仙女河（XNH）的相似性較低，只有45.59%，而不同地區(qū)樣品間的相似性最高只能達(dá)到61.35%，大部分都在50%左右。最終進(jìn)入污水處理廠的城鎮(zhèn)污水包括居民生活污水、服務(wù)業(yè)污水、部分預(yù)處理工業(yè)廢水和初期雨水組成，污水的水質(zhì)受到人為要素的影響，包括經(jīng)濟(jì)發(fā)展、產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)、居民生活習(xí)慣和消費(fèi)習(xí)慣等因素，也會(huì)受到自然要素的影響，如區(qū)域所在地的氣候和水資源情況等，活性污泥的性質(zhì)會(huì)隨著進(jìn)水水質(zhì)的不同而不同，因此相同區(qū)域由于各方面因素較相似從而其活性污泥的菌落結(jié)構(gòu)會(huì)比較類(lèi)似，而不同地區(qū)的污泥差異性會(huì)較大。但是同一地區(qū)不同區(qū)域內(nèi)的產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的差異性同樣會(huì)導(dǎo)致污泥結(jié)構(gòu)的差異。

表3 樣品的相似性矩陣圖

利用聚類(lèi)分析方法對(duì)不同微生物群落進(jìn)行分析，能夠研究微生物群落之間的相互關(guān)系。從細(xì)菌的DGGE 指紋圖譜聚類(lèi)分析（圖2）可以看出，9個(gè)樣品聚為3 類(lèi)：南京地區(qū)的CB、JXZ、JN 和CD為一類(lèi)，廣州地區(qū)的LD、LR 和DTS 為一類(lèi)，沈陽(yáng)地區(qū)的SSW 和XNH 為一類(lèi)。從總體上看，南京地區(qū)與廣州地區(qū)又聚為一大類(lèi)，其相似性大于50%，并且明顯可以看出，同一地區(qū)的不同活性污泥中的優(yōu)勢(shì)菌群也比較相似，說(shuō)明活性污泥的地域性差別非常大，這些可能與各地區(qū)的自然環(huán)境以及人們的生活習(xí)慣有關(guān)。結(jié)合表1 各污水處理廠的工藝特點(diǎn)還可以看出，活性污泥之間的地域差異性高于工藝的差異性。根據(jù)2008年3 月國(guó)務(wù)院第一次全國(guó)污染源普查領(lǐng)導(dǎo)小組辦公室頒發(fā)的“第一次全國(guó)污染源普查城鎮(zhèn)生活源產(chǎn)排污系數(shù)手冊(cè)”，結(jié)合行政區(qū)域和地理環(huán)境因素、城市經(jīng)濟(jì)水平、氣候特點(diǎn)和生活習(xí)慣等將全國(guó)生活污水、生活垃圾的產(chǎn)生和排放系數(shù)劃分為不同的區(qū)域，其中沈陽(yáng)屬于一區(qū)二類(lèi)，南京和廣州均屬于二區(qū)一類(lèi)，并且從氣候方面而言，沈陽(yáng)屬于北溫帶受季風(fēng)影響的半濕潤(rùn)大陸性氣候，南京和廣州都屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，因此可以推斷，南京和廣州地區(qū)的原水結(jié)構(gòu)比較相似，且與沈陽(yáng)地區(qū)的差異性較大，而原水的性質(zhì)會(huì)影響相應(yīng)的活性污泥的性質(zhì)[1]，從而導(dǎo)致了南京和廣州的污泥相似度高于沈陽(yáng)。

圖3 DGGE 圖譜的聚類(lèi)分析

3 結(jié) 論

運(yùn)用純種分離培養(yǎng)的方法和DGGE 法研究了中國(guó)從南方到北方不同地區(qū)的污水處理廠的活性污泥中微生物種群的相似性和差異性。3 個(gè)地區(qū)共分離出89 種細(xì)菌，通過(guò)16S rDNA 序列分析對(duì)不同活性污泥中分離出的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌主要屬于厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、β-變形菌門(mén)（ Bataproteobacteria ） 和 γ- 變 形 菌 門(mén)（Gamaproteobacteria）。DGGE 分析表明活性污泥中的菌種豐富度都非常高，并且不同的樣品間有很多相同的條帶，具有較大的相似性，其中，相同地區(qū)樣品間的相似性大于不同地區(qū)樣品間的相似性，說(shuō)明除了污水處理廠本身運(yùn)行工藝的差別外，不同地區(qū)的自然經(jīng)濟(jì)環(huán)境、人們生活習(xí)慣等因素也會(huì)影響活性污泥中微生物的群落結(jié)構(gòu)。

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