李邦玉，劉 臣，陳 萌，陳 柳，俞 晟，王耀榮

（1.蘇州市職業(yè)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究室，江蘇蘇州 215104;2.蘇州大學(xué)材料與化學(xué)化工部，江蘇蘇州 215123）

化學(xué)家從茶葉中分離出茶多酚后發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)良的抗氧化性，特別是其中兒茶素類化合物具有很活潑的羥基氫，能提供大量的氫質(zhì)子與自由基反應(yīng)，有效地清除人體內(nèi)過(guò)剩的活性氧自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，具有顯著的抗衰老保健作用［1］。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）是兒茶素中的主體成份，自從1929年人們從茶葉中提取分離出來(lái)后，許多科學(xué)工作者對(duì)EGCG生理功效進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)EGCG具有抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗衰老、抗菌消炎、降糖和降壓等多種生物學(xué)功能［2］，所以其被廣泛應(yīng)用于食品、藥品和飲料行業(yè)。

本實(shí)驗(yàn)選用食用級(jí)溶劑作為EGCG的提取純化溶劑，采用安全、經(jīng)濟(jì)的聚酰胺樹(shù)脂分離純化方法，制備適用于食品、化妝品、醫(yī)療、保健用的EGCG產(chǎn)品。該方法簡(jiǎn)便可靠，可以應(yīng)用于工業(yè)化大生產(chǎn)，使得綠茶的下腳料得到合理的應(yīng)用。采用紫外可見(jiàn)光譜法對(duì)EGCG的溫度穩(wěn)定性、EGCG與DPPH·的反應(yīng)等進(jìn)行了初步探索，從光譜圖的變化直觀地判斷體系的內(nèi)部反應(yīng)，粗略得到EGCG體外抗氧化的溫度條件，獲得跟蹤EGCG與DPPH·反應(yīng)的檢測(cè)波長(zhǎng)。以VC等常見(jiàn)抗氧化劑為參照系，采用鄰苯三酚自氧化法研究了EGCG對(duì)·的清除能力，采用DPPH·法研究了EGCG體外抗氧化活性，初步判斷EGCG是一個(gè)很好的天然抗氧劑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DPPH· sigma公司;聚酰胺薄膜層析板 臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠;聚酰胺樹(shù)脂 60～100目，滄州寶恩吸附材料科技有限公司;三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸鹽 上海如吉生物科技發(fā)展有限公司;茶多酚 南京仁信化工有限公司;鄰苯三酚，乙酸乙酯等其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純;綠茶的下腳料 蘇州東山碧螺春茶廠提供。

P230型高效液相色譜儀 配有P230+紫外檢測(cè)器、P230/P230p高壓恒泵，EC2000色譜工作站，大連依利特分析儀器有限公司;RUC－5200型超聲波清洗機(jī) 上海睿祺公司;不銹鋼循環(huán)水多用真空泵 上海滬西分析儀器廠;RE52－3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海滬西分析儀器廠;玻璃層析柱 400mm×15mm，定制;UV1801紫外可見(jiàn)分光光度儀 北京坤健捷誠(chéng)科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 EGCG的分離提純 取綠茶下腳料10g，置250mL容量瓶中，加入95%乙醇150mL，80℃超聲（工作頻率24kHz，功率300W）提取30min，提取兩次，合并提取液，過(guò)濾，80℃減壓回收乙醇，得濃縮液上聚酰胺樹(shù)脂柱，以乙醇－醋酸梯度洗脫，薄層層析跟蹤檢測(cè)，收集EGCG部位流分，脫色，濃縮，重結(jié)晶，得 EGCG純品，液相色譜法檢測(cè)產(chǎn)品成分與純度。

利用液相色譜法分析產(chǎn)品純度及含量。色譜條件為:色譜柱:Shimpak C18（4.6mm ×150mm，5μm）;流動(dòng)相:甲醇－水－冰醋酸（20∶80∶0.2）;檢測(cè)波長(zhǎng):280nm，流速:1.0mL·min－1;柱溫:30℃，進(jìn)樣量 5μL。

1.2.2 不同溫度下EGCG紫外可見(jiàn)吸收光譜圖的測(cè)定 在10mL比色管中盛5mL同一濃度的EGCG溶液，分別置于 20、40、60、80℃ 水浴鍋中恒溫加熱30min，在200～600nm范圍內(nèi)掃描樣品的紫外可見(jiàn)吸收光譜。

1.2.3 選擇 EGCG與 DPPH·反應(yīng)的掃描波長(zhǎng)實(shí)驗(yàn) 按表1方案吸取不同濃度的EGCG乙醇溶液加入直徑1cm比色皿中，再加入3.5mL 0.0176g/L DPPH·乙醇溶液，室溫避光靜置20min后，以50%乙醇作參比，在200～600nm范圍內(nèi)掃描樣品的紫外可見(jiàn)吸收光譜。

表1 EGCG與DPPH·反應(yīng)加樣表Table 1 The scheme of the reaction of EGCG with DPPH·

1.2.4 EGCG清除DPPH·能力測(cè)定

1.2.4.1 溶液的配制 DPPH·標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取20mg DPPH·用無(wú)水乙醇定容于250mL容量瓶中，得到濃度為2×10－4mol/L的DPPH·溶液，貼上標(biāo)簽，暗處保存。

DPPH·標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液:取DPPH·標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用無(wú)水乙醇定容，制備0.0176g/L DPPH·標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，貼上標(biāo)簽，暗處保存。

1.2.4.2 DPPH·標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別從0.0176g/L DPPH·標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液中取0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mL 于比色管中，添加無(wú)水乙醇至10mL，配成濃度分別為3.52、7.04、14.08、28.16、56.32μg/mL 溶液。在 517nm波長(zhǎng)測(cè)定不同濃度DPPH·的吸光度值，繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.3 EGCG清除DPPH·能力測(cè)定 參考Larrauri等［3－5］的方法進(jìn)行清除自由基實(shí)驗(yàn)。按表2方案吸取不同濃度的EGCG乙醇溶液加入直徑1cm比色皿中，再加入3.5mL 0.0176g/L DPPH·乙醇溶液，室溫避光靜置20min后，以50%乙醇作參比，于517nm處測(cè)定其吸光值。按以下公式得出其清除率:

清除率（%）=［1－（A－B）/A0］×100

表2 EGCG清除DPPH·實(shí)驗(yàn)加樣表Table 2 The scheme of the reaction of EGCG with DPPH·

抑制百分?jǐn)?shù)（%）=［（A0－A）/A0］×100

式中:A0為鄰苯三酚的自氧化速率;A為加入樣液后鄰苯三酚的自氧化速率;單位均為吸光度每分鐘的增值。

2 結(jié)果與討論

2.1 EGCG的分離純化及檢測(cè)

2.1.1 EGCG的分離提純 隨著EGCG應(yīng)用領(lǐng)域越來(lái)越廣泛，對(duì)其提取純化制備技術(shù)也提出了更高的要求。要使EGCG能夠極大程度地發(fā)揮醫(yī)療、保健作用，需要一種安全、經(jīng)濟(jì)的EGCG提取純化方法，能夠保證EGCG原料的質(zhì)量穩(wěn)定、安全可控。因此，本實(shí)驗(yàn)選用食用級(jí)的95%乙醇溶劑作為EGCG的提取純化溶劑，用超聲萃取綠茶下腳料，過(guò)濾，減壓，濃縮液上安全、經(jīng)濟(jì)的聚酰胺樹(shù)脂柱分離純化，以乙醇－醋酸梯度洗脫，薄層層析跟蹤檢測(cè)（如圖1所示），發(fā)現(xiàn)乙醇與醋酸體積比為1∶4時(shí)洗脫效果最好。收集EGCG流分，脫色，濃縮，重結(jié)晶，得 EGCG純品。方法簡(jiǎn)便，可以應(yīng)用于工業(yè)化大生產(chǎn)，使綠茶的下腳料作為資源得到合理運(yùn)用。

圖1 EGCG餾分薄層色譜跟蹤圖Fig.1 Thin layer chromatogram of the extracted EGCG products

2.1.2 液相色譜法檢測(cè)EGCG產(chǎn)品成分及含量純化的樣品及EGCG對(duì)照品色譜如圖2、圖3所示。由純化樣品的液相色譜圖可知，EGCG較純，含量大于97%，只混有極少量其它雜質(zhì)。提取收率達(dá)到12%。

圖2 純化樣品的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of the extracted EGCG products

圖3 EGCG對(duì)照品液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of EGCG standard reagent

2.2 紫外可見(jiàn)吸收光譜法考察EGCG受溫度的影響

由圖4可知EGCG在276nm處有特征吸收。

實(shí)驗(yàn)考察了溫度對(duì)EGCG的影響。由圖5可知，溫度升高到40℃后吸收曲線就發(fā)生變化了，當(dāng)溫度升高到60℃后就破壞了EGCG的結(jié)構(gòu)，225nm處吸收峰分裂且強(qiáng)度驟降，276nm處吸收峰消失，而在325nm處的吸收峰變強(qiáng)。吳平等［6］報(bào)道在高溫下，EGCG可能發(fā)生降解、異構(gòu)化、脫沒(méi)食子酸化和自動(dòng)氧化等反應(yīng)，隨著EGCG的下降，有GA的產(chǎn)生，而其異構(gòu)體GCG也明顯增加。所以EGCG在高溫下容易變質(zhì)，應(yīng)在合適的低溫如室溫下考察其抗氧化性能。

圖4 EGCG紫外可見(jiàn)光譜掃描圖Fig.4 UV visible spectroscopy of EGCG

圖5 溫度對(duì)EGCG紫外可見(jiàn)光譜影響圖Fig.5 UV visible spectroscopy of EGCG under different temperature conditions

2.3 EGCG對(duì)DPPH·的清除能力測(cè)定

2.3.1 EGCG與DPPH·反應(yīng)的掃描波長(zhǎng)選擇 從DPPH·在無(wú)水乙醇中的光譜圖6中可見(jiàn)，DPPH·在326nm和517nm處出現(xiàn)兩個(gè)特征吸收。

圖6 DPPH的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖Fig.6 UV visible spectroscopy of DPPH·

EGCG能使紫紅色DPPH·溶液褪色，表明EGCG與DPPH·發(fā)生了反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中嘗試用EGCG與DPPH·發(fā)生反應(yīng)后體系的紫外可見(jiàn)光譜圖來(lái)跟蹤該反應(yīng)。如圖7所示，EGCG在517nm處沒(méi)有吸收，而DPPH·中添加了EGCG后，其吸收光譜圖發(fā)生了明顯變化，在326nm和517nm處兩個(gè)特征吸收都失去了特征性，在425nm處出現(xiàn)新的寬吸收峰。

圖7 EGCG與DPPH·反應(yīng)中光譜變化圖Fig.7 UV visible spectroscopy changes of the reaction system of EGCG with DPPH·

同時(shí)，不同濃度的EGCG與DPPH·發(fā)生反應(yīng)后體系的紫外可見(jiàn)光譜圖如圖8所示，除了發(fā)現(xiàn)反應(yīng)體系的圖譜與DPPH·的吸收光譜圖不同之外，體系的光譜在DPPH·517nm處吸收強(qiáng)度隨EGCG濃度的增大而有規(guī)律地依次降低。而DPPH·另一特征吸收326nm處的吸收強(qiáng)度變化沒(méi)有規(guī)律性，所以通常借助517nm處的吸收強(qiáng)度變化來(lái)評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化活性［7］。實(shí)驗(yàn)比較了VC和茶多酚分別與DPPH·反應(yīng)后體系的紫外可見(jiàn)光譜圖，發(fā)現(xiàn)上述兩個(gè)反應(yīng)體系的圖譜變化規(guī)律類似于EGCG與DPPH·反應(yīng)體系的光譜變化規(guī)律。通過(guò)紫外可見(jiàn)光譜法初步探討了DPPH·與溫度的關(guān)系，如圖9所示。溫度升高，DPPH·自由基的顏色明顯褪去。從圖9上可知不同溫度下的光譜圖差別很大，517nm處的特征吸收強(qiáng)度逐漸降低，而425nm寬峰處吸收強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，326nm處特征吸收沒(méi)有太大變化。所以溫度過(guò)高使得517nm處特征吸收消失，不利于利用517nm處的吸收強(qiáng)度變化來(lái)評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化活性。

圖8 不同濃度的EGCG與DPPH·發(fā)生反應(yīng)后體系的光譜圖Fig.8 UV visible spectroscopy of the reaction system of different concentrations EGCG with DPPH·

總之，在討論抗氧化劑消除DPPH·的反應(yīng)時(shí)，應(yīng)選擇517nm波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)，同時(shí)在較低溫度如室溫下進(jìn)行。

2.3.2 DPPH·標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線 利用DPPH·在無(wú)水乙醇中的517nm處的特征吸收，繪制DPPH·標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出DPPH·標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.0151+0.0281x（R=0.999909），如圖10所示。在0～60μg/mL范圍內(nèi)DPPH·乙醇溶液濃度與吸光度值之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖9 DPPH·在不同溫度下紫外可見(jiàn)光譜圖Fig.9 UV visible spectroscopy of DPPH·under different temperature conditions

圖10 DPPH·標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.10 Standard curves of DPPH·standard solution

2.3.3 EGCG清除DPPH· 圖11是EGCG對(duì)DPPH·清除效果圖。由該圖可知，EGCG對(duì)DPPH·有很強(qiáng)的清除作用，清除率隨EGCG濃度的增加而上升，在EGCG濃度為32μg/mL時(shí)清除率達(dá)到80%，其IC50值約為12μg/mL。同時(shí)，用茶多酚、維生素C標(biāo)準(zhǔn)品做比較實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)EGCG的清除效果比VC好，但不如市售茶多酚，可能是市售茶多酚里面不僅含有EGCG，還含有其他成分，某些成分的清除效果應(yīng)比EGCG還好。

圖11 EGCG對(duì)DPPH·自由基清除圖Fig.11 Scavenging effects of EGCG on DPPH·

圖12 EGCG對(duì)·清除圖Fig.12 Scavenging effects of EGCG on ·

3 結(jié)論

本文成功地從綠茶下腳料中提取出了純度很高的EGCG單體。EGCG在低溫如室溫下比較穩(wěn)定，適宜考察其抗氧化性能。在室溫等低溫下于517nm波長(zhǎng)處監(jiān)測(cè)抗氧化劑EGCG清除DPPH·的性能比較合適。EGCG對(duì)自由基有較強(qiáng)清除作用，清除DPPH·、·的能力比維生素C強(qiáng)，其清除上述兩類自由基的IC50值分別為 12μg/mL 和 5.9μg/mL?？傊?，EGCG是一種較好的天然抗氧化劑。

［1］鄔新榮，王岳飛，張士康，等.茶多酚保健功能研究進(jìn)展與保健食品開(kāi)發(fā)［J］.茶葉科學(xué)，2010，30:501－505.

［2］Jane V，Higdon B F.Tea catechins and polyphenols:health effects，metabolism，and antioxidant functions［J］.Crit Rev Food Science and Nutrition，2003，43（1）:89－143.

［3］Larraufi J A，Sanchez M C，Saura C F.Effect of temperature on the free radical scavenging capacity of extracts from red and white grape pomaee peels［J］.J Agic Food Chem，1998，46（7）:2694－2697.

［4］劉朝霞，胡士德，鄒坤，等.資木瓜乙醇提取物的體外抗氧化活性研究［J］.三峽大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2008，30（4）:72－75.

［5］李紅，張?jiān)?應(yīng)用DPPH·法測(cè)定蘋(píng)果提取物的抗氧化能力［J］.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2005，36（1）:35－39.

［6］吳平.表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的熱穩(wěn)定性研究［D］.合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011:2－4.

［7］余芳，安辛欣.富硒綠茶中茶多酚及水提物的抗氧化活性研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（8）:298－300.