陳華艷 尹延彥 葉凡 ?？?王蕾

微波熱療增強視網(wǎng)膜母細胞瘤化學治療效應的體外研究△

陳華艷 尹延彥 葉凡 常俊標 王蕾

微波熱療；視網(wǎng)膜母細胞瘤；化療；阿霉素

目的研究微波熱療對提高阿霉素(doxorubicin，DOX)體外抑制人RB Y79細胞的作用。方法分別使用MTT法、熒光顯微鏡、流式細胞儀檢測人RB Y79細胞的存活率、攝取及凋亡情況；使用分光光度法檢測Y79細胞內(nèi)Caspase-3的活性。將實驗分為空白對照組、DOX組、微波熱療組、DOX+微波熱療組，分別將4組進行以上細胞實驗。結(jié)果DOX+微波熱療組與其他組相比細胞存活率明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。細胞熒光攝取實驗表明，DOX+微波熱療組與DOX組相比，其細胞穿透效果在60 min內(nèi)呈明顯上升趨勢。DOX+微波熱療組72 h細胞凋亡率可達(49.08±1.02)%，可有效促進細胞凋亡，與其他各組相比差異有明顯統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)。同時，DOX組、微波熱療組、DOX+微波熱療組、空白對照組人RB Y79細胞的Caspase-3活性分別為2.88±0.16、1.61±0.09、4.67±0.27、1.00±0.05，微波熱療+DOX可以有效提升細胞內(nèi)Caspase-3活性，與其余各組間差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。結(jié)論微波熱療可以有效提高人RB Y79細胞體外化學治療的效果，此療法是一種很有前景的治療視網(wǎng)膜母細胞瘤的方法。

[眼科新進展，2014，34(7):620-623]

視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)是一種起源于視網(wǎng)膜胚胎性核層細胞的惡性腫瘤，也是嬰幼兒時期眼內(nèi)惡性程度最高的腫瘤[1]。RB經(jīng)過早期保守治療后生存率可顯著提高[2]。目前，RB常用的治療手段主要有放射療法、化學療法、分子基因療法等[3-5]。熱療是近年發(fā)展起來的一種治療癌癥的新方法，是利用外加能量使腫瘤溫度上升至有效治療溫度殺滅腫瘤細胞。阿霉素(doxorubicin，DOX)是目前臨床常用的一種廣譜抗癌藥，具有熱療增敏性和pH敏感性[6]。研究表明，熱療與化學治療聯(lián)合可以起到協(xié)同增效的作用[7]。本實驗旨在探討微波熱療對RB Y79細胞的DOX化學治療增敏作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器DOX(美國Aldrich Sigma公司)、DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)、胎牛血清(四季青公司)、四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國Hyclone公司)、細胞凋亡試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)、人 RB Y79 細胞(美國模式培養(yǎng)物集存庫)。酶標儀(加拿大DYNEX公司)、流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)、UHR-2000高能聚束微波熱療機(華源醫(yī)療設備有限公司)、高效液相色譜儀(島津公司)。

1.2細胞培養(yǎng)將RB Y79細胞培養(yǎng)在含體積分數(shù)15%胎牛血清、體積分數(shù)1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中。細胞培養(yǎng)箱條件為37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2。細胞接種24 h后，使用工作濃度的DOX與培養(yǎng)基混合液作為細胞培養(yǎng)液，在42 ℃條件下微波加熱2 h，然后繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h或72 h。

1.3DOX工作濃度測定DOX設0.125 mg·L-1、0.250 mg·L-1、0.500 mg·L-1、1.000 mg·L-1、2.000 mg·L-1、4.000 mg·L-1、8.000 mg·L-17組，每組3個復孔，使用MTT法測定細胞抑制率，以48 h的IC50為工作濃度。

1.4MTT法測定細胞增殖率將RB Y79細胞以每孔5.5×103個接種到96孔培養(yǎng)板中，每組設3個復孔，培養(yǎng)時間分別為24 h、48 h、72 h。實驗組分為空白對照組、DOX組、微波熱療組和DOX+微波熱療組(使用工作濃度的DOX與培養(yǎng)基混合液作為細胞培養(yǎng)液，在42 ℃條件下微波加熱2 h)。終止培養(yǎng)前4 h，每孔加MTT 10 μL。4 h后，每孔加入150 μL三聯(lián)液，室溫孵育過夜。第2天，全自動定量繪圖酶標儀測定每孔的 570 nm 波長吸光度(A)值，重復測量3次。計算公式:細胞存活率=(1-實驗組A值)/對照組A值×100%。

1.5DOX細胞熒光攝取檢測將密度為0.15×106個/孔的Y79細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入1.3 mg·L-1DOX進行刺激(此濃度為IC50計算出的濃度)，同時設定空白對照組、微波熱療組、DOX組及DOX+微波熱療組，于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每組分別培養(yǎng)5 min、30 min、60 min。培養(yǎng)完畢后，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗后并固定細胞，置于熒光顯微鏡下檢測。

1.6細胞凋亡率檢測分組方法參照1.5，于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，使用PBS洗滌3次；加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞后，加入5 μL Annexin V-FITC混勻；再加入5 μL Propidium Iodide，混勻，室溫、避光反應5～15 min；1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7Caspase-3活性檢測分組方法參照1.5，于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將細胞重新懸浮于 50 μL冷細胞裂解緩沖液中，冰上放置10 min。4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min。將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，置于冰上。向每組加入50 μL的2×反應緩沖液/二硫蘇糖醇(DTT)混合液。向每管加入5 μL 1 mmol·L-1Caspase-3底物，水浴37 ℃孵育1 h。在405 nm波長下讀取A值。根據(jù)試劑盒說明所得斜率值計算 Caspase-3活性。

1.8統(tǒng)計學方法應用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果采用均數(shù)±標準差表示，采用單向方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1DOX工作濃度的確定MTT法檢測結(jié)果顯示，0.125 mg·L-1、0.250 mg·L-1、0.500 mg·L-1、1.000 mg·L-1、2.000 mg·L-1、4.000 mg·L-1、8.000 mg·L-1DOX分別作用于人RB Y79細胞后，各組細胞抑制率分別為(3.56±0.29)%、(9.74±0.91)%、(26.88±2.31)%、(34.75±3.24)%、(59.62±4.28)%、(76.71±4.54)%、(95.04±5.27)%。人RB Y79細胞對DOX的IC50為1.3 mg·L-1，并以此藥物濃度進行各項實驗。

2.2各組細胞的增殖率細胞分別培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后，抑制率出現(xiàn)明顯變化(表1)。DOX+微波熱療組與空白對照組相比，24 h、48 h及72 h差異均有顯著統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)；與微波熱療組相比，24 h差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，48 h及72 h時差異均有顯著統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)；與DOX組相比，24 h、48 h及72 h差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。

表1 各組人RB Y79細胞存活率Table 1 Cell viability for human RB Y79 cells(±s，rate/%)

2.3微波熱療促進細胞對DOX的攝取經(jīng)微波熱療處理后，細胞內(nèi)DOX的熒光明顯增強。在60 min中人RB Y79細胞中沒有明顯的紅色熒光，但是經(jīng)過微波處理后的細胞在微波熱療5 min后，就開始有紅色熒光出現(xiàn)。60 min時已經(jīng)可以看到細胞內(nèi)明顯的紅色熒光(圖1)。結(jié)果表明，微波熱療可以提高人RB Y79細胞對DOX的穿透及蓄積能力。

Figure 1 Fluorescent microscopic images of cells in DOX group and DOX combined with microwave treatment(×400) DOX組及DOX+微波熱療組的細胞明場及熒光圖片(×400)

表2 人RB Y79細胞在24 h、48 h和72 h的凋亡率Table 2 Apoptotic rate of human RB Y79 cells at 24 hours,48 hours and 72 hours(±s)

2.4微波熱療促進DOX化學治療對細胞的凋亡DOX組、微波熱療組及DOX+微波熱療組細胞凋亡率均較空白對照組明顯升高(均為P<0.01，見表2)；DOX+微波熱療組的細胞凋亡率較DOX組、微波熱療組的凋亡率均有明顯升高(均為P<0.01)。

2.5微波熱療誘導人RBY79細胞中的Caspase-3的作用按照實驗操作處理24 h后，DOX組、微波熱療組、DOX+微波熱療組、空白對照組人RB Y79細胞的Caspase-3活性分別為2.88±0.16、1.61±0.09、4.67±0.27、1.00±0.05，DOX+微波熱療組人RB Y79細胞的Caspase-3活性增強，與其余各組比較差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。

3 討論

DOX是目前臨床常用的一種廣譜抗癌藥，可用于多種腫瘤的治療[8-10]。DOX在進行腫瘤化學治療時具有明顯的熱療增敏性和pH敏感性，將熱療與化學治療聯(lián)合應用可以對化學治療起到增效作用[11]。腫瘤組織及其周圍血管對溫度具有敏感性，利用微波熱療的方法可有效將其殺滅[12]。近年來，腫瘤熱療受到了人們的廣泛關(guān)注。同時，熱療和化學治療聯(lián)合治療腫瘤具有明顯的增強作用，其原因可能是熱療使藥物滲入細胞量增加、蛋白質(zhì)變性及化學治療藥物的藥動學改變等。本研究探討了微波熱療對DOX進入細胞的促進作用，結(jié)果表明，經(jīng)過微波和DOX共同作用的細胞，在作用5 min后，細胞內(nèi)就出現(xiàn)明顯的熒光，表明微波熱療可以有效促進DOX快速進入靶細胞。

研究者認為熱療殺滅細胞的臨界溫度為42 ℃[13]，目前臨床所使用的熱療溫度多數(shù)在41～43 ℃之間，因此本研究中微波熱療的處理溫度設定為42 ℃。張福明等[6]使用KG-1a細胞研究了熱療對DOX治療的增敏作用，發(fā)現(xiàn)熱療可以增加DOX對KG-1a細胞的殺傷作用，提高腫瘤細胞的凋亡率，結(jié)果表明40 ℃、42 ℃熱療聯(lián)合化學治療組的細胞抑制率明顯高于化學治療組和單純熱療組(均為P<0.01)。各處理組的細胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.01)，40 ℃、42 ℃熱療聯(lián)合化學治療組細胞凋亡率明顯高于化學治療組和單純熱療組(均為P<0.01)。王向軍等[14]研究了DOX對U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞在熱療條件下的增敏作用，結(jié)果表明熱療聯(lián)合DOX化學治療能增強對U251細胞的體外抑制作用，提高腫瘤細胞的凋亡率，通過聯(lián)合熱療有效下調(diào)P-gp及Bcl-2蛋白的表達，提高U251細胞對DOX化學治療的敏感性。以上實驗均證明DOX本身具有熱療增敏特性，但是熱療的方法與本研究不同，本研究使用的是微波熱療。實驗結(jié)果表明，在聯(lián)合微波熱療的條件下，DOX可迅速進入細胞內(nèi)部，促進細胞凋亡。此熱療方法與其他熱療方法相比優(yōu)勢明顯:首先此熱療方法已用于臨床腫瘤的相關(guān)治療；其次，微波熱療法可以有效穿透人體組織，達到治療人體深層腫瘤的目的；并且，此熱療法可使病變部位快速達到指定溫度，從而減少患者的痛苦。

本研究結(jié)果表明，微波熱療不僅可以有效促進DOX快速進入細胞內(nèi)部，并且可以有效協(xié)同DOX增強細胞抑制率，促進細胞凋亡。凋亡是由Caspases家族成員介導的蛋白酶級聯(lián)反應過程，即Caspase在凋亡誘導信號的作用下，啟動型Caspases先通過結(jié)合特異輔因子激活，發(fā)揮水解蛋白的作用，從而激活下游效應型Caspases，一旦效應 Caspases被激活，便大范圍水解細胞內(nèi)的靶物質(zhì)，從而降解細胞內(nèi)蛋白，最終使細胞進入不可逆死亡階段[15]。Caspase-3是白細胞介素 1-β轉(zhuǎn)化酶家族成員之一，是多種凋亡途徑的共同下游效應部分，在細胞凋亡過程中占據(jù)核心地位，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”[16]?；罨蟮腃aspase-3酶解切割DNA依賴的蛋白激酶和聚腺苷二磷酸核糖多聚酶等，從而影響DNA復制、轉(zhuǎn)錄和損傷修復[17]。本研究通過對人RB Y79細胞中Caspase-3活性的考察，探討了微波熱療對Caspase-3活性的促進作用，抗腫瘤機制的重點是使細胞產(chǎn)生凋亡，而激活Caspase-3在腫瘤凋亡作用中具有重要意義。

本研究不僅證實了微波熱療對DOX體外抗腫瘤的協(xié)同作用，可以有效協(xié)同DOX抑制Y79細胞的增殖，并且能有效促進細胞的凋亡，提高了Y79細胞對DOX化療的敏感性，這為RB的治療提供了一種有效的治療手段。

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date:Dec 7，2013

Youth National Nature Science Foundation of China(No:81302717)From theSchoolofBasicMedicine，ZhengzhouUniversity(CHEN Hua-Yan)，Zhengzhou450001，HenanProvince，China；CollegeofPublicHealth，ZhengzhouUniversity(YIN Yan-YannowworksattheDepartmentofPublicHealth，XinxiangMedicalUniversity)，Zhengzhou450001，HenanProvince，China；SchoolofPharmaceuticalSciencesofZhengzhouUniversity(YE Fan)，Zhengzhou450001，HenanProvince，China；SchoolofChemistryandMolecularEngineering，ZhengzhouVnirersity(CHANG Jun-Biao),Zhengzhou450001,HenanProvince,China;SchoolofChemistryandMolecularEngineering，SchoolofPharmaceuticalSciences，ZhengzhouUniversity(WANG Lei)，Zhengzhou450001，HenanProvince，China

Microwave hyperthermia enhancing chemotherapeutic efficacy in retinoblastoma cells in vitro

CHEN Hua-Yan，YIN Yan-Yan，YE Fan，CHANG Jun-Biao,WANG Lei

microwave hyperthermia；retinoblastoma；chemotherapy；doxorubicin

ObjectiveTo study the ability of microwave hyperthermia in enhancing chemotherapeutic efficacy of doxorubicin (DOX) against human retinoblastoma Y79 cellsinvitro.MethodsMTT method was used to detect the viability of Y79 cells,cellular uptake of Y79 cells was determined by fluorescence microscopy,cell apoptosis was detected by flow cytometry,and spectrophotometric method was used to detect the expression of Caspase-3 in Y79 cells.The experiments were divided into 4 groups:blank control group,DOX group,microwave treatment group and DOX combined with microwave treatment group,and these groups were experimented,respectively.ResultsThe Y79 cells exposed to DOX with microwave treatment showed a significant decrease in cell viability which compared with other groups (allP<0.05).The cellular uptake results showed that the cells increased permeability to DOX immediately with the addition of microwave compared with DOX alone,which continued to increase over 60 minutes.Apoptotic rate of cells treated with DOX and microwave hyperthermia was (49.08±1.02)%,and it could enhance the apoptosis rate compared to other experimental groups (allP<0.01).Meanwhile,the activity of Caspase-3 in cells of blank control group,DOX group,microwave treatment group and DOX combined with microwave treatment group were 2.88±0.16,1.61±0.09,4.67±0.27 and 1.00±0.05,respectively,DOX with microwave treatment could enhance the activity of Caspase-3 in cells,there were statistical differences compared with other groups (allP<0.05).ConclusionMicrowave hyperthermia can enhance the chemotherapeutic efficacy against retinoblastoma Y79 cellsinvitro,DOX combined with microwave treatment is a promising approach for retinoblastoma.

陳華艷，女，1969年7月出生，實驗技師。聯(lián)系電話:15136400500；E-mail:15136400500@139.com

AboutCHENHua-Yan:Female，born in July，1969.Tel:1513640-0500；E-mail:15136400500@139.com

2013-12-07

國家自然科學基金青年基金項目(編號:81302717)

450001 河南省鄭州市，鄭州大學基礎醫(yī)學院(陳華艷)；450001 河南省鄭州市，鄭州大學公共衛(wèi)生學院(尹延彥現(xiàn)工作于新鄉(xiāng)醫(yī)學院公共衛(wèi)生系)；450001 河南省鄭州市，鄭州大學藥學院(葉凡)；450001 河南省鄭州市，鄭州大學化學與分子工程學院(?？?；450001 河南省鄭州市，鄭州大學化學與分子工程學院、鄭州大學藥學院(王蕾)

王蕾，E-mail:hahalei@139.com

陳華艷，尹延彥，葉凡，?？?，王蕾．微波熱療增強視網(wǎng)膜母細胞瘤化學治療效應的體外研究[J]．眼科新進展，2014，34(7)：620?623．

10．13389/j．cnki．rao．2014．0170

【實驗研究】

修回日期:2014-03-10

本文編輯:付中靜

Accepteddate:Mar 10，2014

Responsibleauthor:WANG Lei，E-mail:hahalei@139.com

[RecAdvOphthalmol，2014，34(7):620-623]