李嘉嘉 陳振 劉伯玉 Adams Latif 劉洋 李川 李阿茜 梁米芳 李德新 柳燕

230032合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)微生物教研室（李嘉嘉、陳振、劉伯玉、Adams Latif、柳燕）；102206北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所（劉洋、李川、李阿茜、梁米芳、李德新）

脾臟是機體最大的免疫器官，是機體細胞免疫和體液免疫的中心。脾臟FRCs是重要的淋巴基質(zhì)細胞之一，它建立細胞網(wǎng)絡(luò)，分泌趨化因子以吸引T細胞和樹突狀細胞，滋養(yǎng)這兩種免疫細胞并參與抗原遞呈［1］；FRCs通過抑制效應(yīng)T細胞和支持調(diào)節(jié)T細胞來調(diào)節(jié)T細胞功能［2］；FRCs本身在炎癥反應(yīng)中起作用，其標志性蛋白Podoplanin在局部炎癥時能與DC細胞的CLEC-2蛋白相互作用，參與淋巴結(jié)的重塑反應(yīng)［3］。FRCs自身也是 SFTSV、埃博拉病毒、拉沙熱病毒、馬爾堡病毒等出血熱病毒直接感染的靶細胞［4］。其中SFTSV是由我國科學(xué)家團隊首先分離、發(fā)現(xiàn)并命名的布尼亞病毒目Phenuiviridae科白蛉病毒屬的新病毒［5］。項目組研究發(fā)現(xiàn)，在致死性感染動物模型中，SFTSV感染的主要靶器官是脾臟，而脾臟的FRCs是SFTSV致死性感染的主要靶細胞［6-7］，美國Hideki Ebihara團隊的動物模型實驗［8］和日本學(xué)者發(fā)布的SFTSV感染死亡患者尸檢報告［9］也證實這一結(jié)論。但由于脾臟網(wǎng)狀纖維細胞分離困難，沒有市售的成品細胞系，F(xiàn)RCs在SFTSV、埃博拉病毒、馬爾堡病毒等出血熱癥候群病毒感染中引起的致死機制鮮有報道，建立永生化的FRCs顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 FRCs的分離、培養(yǎng)與永生化 選取4周齡小鼠，處死取脾臟，剪碎后加入5 ml消化液（含0.8 mg／ml金屬酶、0.2 mg／ml 膠原酶 P、0.1 mg／ml DNA酶I的DMEM，均購自羅氏公司）37℃消化15 min，離心去除消化液，細胞沉淀用4℃ FACS緩沖液（含 2%FBS 5 mmol／L EDTA 的 PBS）重懸，200目濾網(wǎng)過濾；胎盤藍染色計數(shù)，加入CD45磁珠抗體（德國Miltemyi Biotec GmbH），4 ℃孵育 30 min，使用autoMACS（德國Miltemyi Biotec GmbH）系統(tǒng)的陰性分選程序，富集CD45陰性的細胞群；富集產(chǎn)物按每106細胞加100μl抗體工作液，4℃避光反應(yīng)30 min，PBS洗兩次，重懸過濾后使用MoFlo XDP（美國Beckman Coulter，Inc公司）分選 CD45-CD31-podoplanin＋的細胞群（100μm 噴頭、純化模式），分選產(chǎn)物計數(shù)后接種；75 CM2培養(yǎng)瓶接種純化的原代FRCs細胞，待細胞達到70% ～80%覆蓋，加入維持液（2%FBS、1%雙抗的 DMEM）稀釋的 SV40（MOI值為2，上海吉滿生物科技有限公司）37℃震蕩孵育1 h，補足15 ml維持液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，換用2μg／ml嘌呤霉素的營養(yǎng)液培養(yǎng)；篩選后的細胞進行單克隆培養(yǎng)，選取生長較好的克隆細胞，進行傳代培養(yǎng)；低濃度胰蛋白酶短時消化培養(yǎng)的細胞，PBS洗兩次，細胞重懸后，按每106細胞加100μl抗體工作液，4℃避光反應(yīng)30 min，PBS洗兩次，重懸過濾后上FACS CantoⅡ（美國 BD公司）檢測 CD45-CD31-podoplanin＋的細胞群比例，選出符合表型細胞克隆傳代培養(yǎng)50代以上。

1.2 FRCs克隆株的生長曲線和克隆形成實驗選取生長旺盛的原代 FRCs細胞、Clone01和Clone02細胞消化、懸浮、計數(shù)，各取20 000個活細胞，分別接種于96孔培養(yǎng)板，每天進行細胞計數(shù)，統(tǒng)計5 d內(nèi)每天的細胞數(shù)量；稀釋Clone01和Clone02，低密度（400個每皿）接種于培養(yǎng)皿培養(yǎng)1周后，統(tǒng)計形成的集落數(shù)。

1.3 原代FRCs和永生化FRCs的轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)分析 在75 CM2培養(yǎng)瓶接種純化的原代FRCs細胞和永生化的Clone02 FRCs（每種細胞3個生物重復(fù)）加營養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，使用低濃度胰蛋白酶短時消化培養(yǎng)的細胞，4℃ 預(yù)冷的PBS洗3次（每次離心條件為4℃ 300×g離心3 min），細胞沉淀使用3 ml Trizol完全溶解，干冰運輸至華大基因公司質(zhì)檢合格后進行建庫測序。

1.4 永生化FRCs免疫表型驗證和SFTSV感染實驗 永生化的Clone02 FRCs接種到Chamber Slide（美國Thermo Scientific），待細胞達到70% ～80%覆蓋（約 24 h），加入維持液（2%FBS、1% 雙抗的DMEM）稀釋的病毒（分4組，MOI值分別為0，0.5，2，10）37oC 震蕩孵育1 h，PBS洗3 遍，加維持液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸去維持液，PBS洗3遍，預(yù)冷的固定液（甲醇和丙酮1∶1）固定 10 min，吸去固定液，-20oC保存待用。Chamber內(nèi)固定的Clone02 FRCs，未感染的細胞分出兩組分別加入PBS稀釋的抗小鼠podoplanin和CD31抗體、podoplanin和抗成纖維細胞抗體，感染的細胞和對照組分別加入PBS稀釋的抗小鼠podoplanin和SFTSV全病毒抗體，濕盒內(nèi)37℃孵育1 h，PBS洗3次，晾干后加入伊文思藍稀釋液稀釋后的兩種相應(yīng)的熒光二抗，濕盒內(nèi)37℃孵育1 h，PBS洗3次；使用DAPI工作液染色10 min，PBS洗3次，用激光共聚焦顯微鏡（德國徠卡TCS SP8）拍照。

A，Clone01和Clone02克隆形成實驗的形態(tài)圖.B，Clone02克隆形成實驗的形態(tài)圖.C，Clone01和Clone02克隆形成率柱狀對比圖.D，原代細胞、Clone01和Clone02的生長曲線的折線圖，Y軸表示細胞數(shù)量，X軸代表細胞生長的時間圖1 Clone02和Clone01的克隆形成實驗和生長曲線A，The microscopic photographs of clone formation of Clone 01.B，The microscopic photographs of clone formation of Clone 02.C，The colony forming efficiency of Clone 01 vs Clone 02.D，The growth curve of Clone 02，Clone 01，primary FRCs.The graphs represent the number of cells counted （Y-axis） from each culture once per day during 5 days（X-axis）Fig.1 Colony forming and expansion rate of Clone 02 and Clone 01

2 結(jié)果

2.1 原代FRCs和永生化FRCs體外分離、培養(yǎng)結(jié)果 培養(yǎng)4 h后，會有少量不貼壁的細胞，換液后可清除，多色流式細胞儀鑒定細胞純度達到99%。分離純化的原代細胞體外可穩(wěn)定傳代多次，細胞較大，卵圓或星形，多突，胞核呈橢圓形，胞質(zhì)顆粒較多，細胞融合后規(guī)則排列，呈放射狀或渦旋走形。分離到4個永生化克隆株，其中只有Clone01和Clone02與原代的免疫表型相同，Clone03表達了 CD45，而Clone04的podoplanin表達減弱；Clone01細胞胞體變小，變圓，生長和分布形態(tài)變化很大，Clone02形態(tài)則與原代FRCs相同。

2.2 FRCs永生化細胞的生長曲線和克隆形成實驗結(jié)果 Clone01所形成的集落和Clone02差別較大，Clone01形成的集落較小，Clone02形成的集落交大，常部分融合，Clone02的克隆形成率低于Clone01。原代細胞和Clone02的生長曲線較為接近，Clone01的生長曲線與它們差異顯著（圖1）。

2.3 原代FRCs與永生化FRCs的轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)分析結(jié)果 原代 FRCs、Clone02的 CD31、podoplanin和CD45基因表達定量結(jié)果與流式細胞儀結(jié)果接近。據(jù)表中各基因表達的fpkm值（小于等于1為極低表達水平的基因，1～10之間的為較低表達水平的基因，大于等于10的為中高表達水平的基因），發(fā)現(xiàn)二種細胞表型均為成纖維細胞標記和podoplanin中高強度表達，CD45和CD31極低水平表達（見表1）。樣本相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，各樣本生物重復(fù)之間相關(guān)性均不小于0.99，生物重復(fù)之間差異小，樣本代表性強。Clone02和原代FRCs相關(guān)性較好，生物重復(fù)兩兩比較的pearson相關(guān)系數(shù)在0.965到0.980之間（圖2）。

表1 轉(zhuǎn)錄組測序分析FRCs標志抗原基因表達的結(jié)果Tab.1 Gene expression analysis of FRCs markers by RNA-seq

2.4 永生化FRCs免疫表型驗證 和SFTSV感染實驗結(jié)果 通過激光共聚焦技術(shù)結(jié)果證明：在Clone02細胞上，表達成纖維細胞標志和podoplanin，不表達 CD31（圖3）；在 MOI值0.5 的低濃度下，SFTSV就可以感染Clone02細胞，SFTSV病毒顆粒在細胞內(nèi)染色呈綠色沙粒狀（圖4）。

3 討論

FRCs由于其在脾臟中含量低于0.1%，體外分離純化難度較大，采用磁珠分選富集和流式細胞儀精確分選逐級分選方法，保證了分選的效率和純度；FRCs不表達造血細胞標志抗原CD45和表皮細胞標志抗原 CD31，特異的表達淋巴標記抗原podoplanin，3種抗體組合可以排除白細胞、血管內(nèi)皮細胞、淋巴內(nèi)皮細胞等的干擾，同時流式細胞術(shù)、轉(zhuǎn)錄組測序基因表達分析和激光共聚焦技術(shù)聯(lián)合使用，保證實驗結(jié)果的準確、可靠［10］。

X、Y軸代表每個樣本，每個樣本3個生物重復(fù)，樣本之間、各生物重復(fù)之間進行兩兩比較，方格的顏色越深、數(shù)值越高代表相關(guān)性越好，顏色越淺相關(guān)性越差圖2 兩種樣品間Pearson相關(guān)性分析熱圖Both X and Y axis represent each sample and its three biological repeats.The darker color and higher value inside indicate higher Pearson correlation，while the lighter and lower ones mean lower Pearson correlationFig.2 Heatmap of Pearson correlation between samples

激光共聚焦結(jié)果證實Clone02細胞表達成纖維細胞標記和淋巴標記podoplanin，不表達表皮細胞標記CD31圖3 Clone02免疫表型的驗證結(jié)果Under a Confocal Microscopy，Clone 02 cells express the key surface marker podoplanin and fibroblasts marker，do not express endothelial cells marker CD31Fig.3 Polychromatic fluorescent labeled Clone 02 cells

轉(zhuǎn)錄組測序的樣品相關(guān)分析通過基因表達譜從宏觀上證明了永生化細胞與原代細胞的相似性。Pearson相關(guān)分析顯示Clone02株細胞與原代細胞基因表達譜相似，提示永生化的細胞很好的保留了原代細胞的功能和特性。

體外感染實驗說明Clone02保留了體內(nèi)FRCs細胞可以被 SFTSV 感染的特性［6-7，11］，因此可以推斷FRCs Clone02與原代細胞生物學(xué)特征接近，免疫表型接近，基因表達譜相似，可以被SFTSV感染，是一個潛在的進行體外FRCs細胞的功能及SFTSV感染機制研究的細胞平臺。

藍色為細胞核，綠色沙粒狀的為病毒染色，紅色標記為FRCs特異標記podoplanin，三色合并為一張彩色圖圖4 感染SFTSV后Clone02的激光共聚焦結(jié)果Under a Confocal Microscopy，nucleus stained with DAPI emit bright blue light， viral particles of SFTSV green fluorescence，podoplanin in cytoplasm of Clone 02 red light.Pictures of three colors are merged in oneFig.4 Polychromatic fluorescent labeled SFTSV infected Clone02

利益沖突 無