HPLC法測(cè)定薄荷苯酚軟膏中苯酚的含量

蔡 樂(lè)，白 林，徐風(fēng)華，任 韡，王歡歡（解放軍總醫(yī)院藥品保障中心，北京 100853）

薄荷苯酚軟膏為《中國(guó)人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》（2002年版）中收載的皮膚科外用制劑，由苯酚、薄荷腦、凡士林和羊毛脂組成，具有止癢、消毒的作用，臨床中可用于瘙癢性皮膚病、銀屑病、神經(jīng)性皮炎等疾病。苯酚是薄荷苯酚軟膏中的主要成分，《中國(guó)藥典》（2010年版）中苯酚原料藥的含量測(cè)定方法為溴量法[1]，《中國(guó)人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》（2002年版）中該制劑苯酚含量測(cè)定方法為紫外分光光度法[2]。因軟膏基質(zhì)的影響，用上述方法測(cè)定時(shí)，操作繁瑣，測(cè)定結(jié)果易受提取等因素的干擾。為更好地控制該制劑的質(zhì)量，本研究對(duì)薄荷苯酚軟膏中苯酚的測(cè)定方法進(jìn)行改進(jìn)，建立HPLC法測(cè)定薄荷苯酚軟膏中苯酚的含量。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀（包括1200系列在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、VWD檢測(cè)器、色譜工作站，美國(guó)Agilent公司）；AG-285型電子天平（瑞士Mettler公司）；KQ-2200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

薄荷苯酚軟膏（本院自制，批號(hào)20130515-1、20130515-2、20130515-3）；苯酚（重慶西南制藥二廠有限責(zé)任公司，批號(hào)1209004）；甲醇為色譜純；乙醇為分析純；水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（60∶40）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：271 nm；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取苯酚約9.0 g，精密稱定，置于200 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含苯酚45 mg的儲(chǔ)備液A。精密移取2 mL儲(chǔ)備液A置于100 mL量瓶中，加流動(dòng)相定容，搖勻，制成每1 mL含苯酚900 μg的儲(chǔ)備液B。精密移取1 mL儲(chǔ)備液B置于25 mL量瓶中，加流動(dòng)相制成每1 mL含苯酚為36 μg的對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取供試品約0.5 g（含苯酚約5 mg），精密稱定，用80 ℃的無(wú)水乙醇將其軟化并轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇適量，于60 ℃下超聲15 min（功率660 W，頻率28 kHz），放至室溫用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，揺勻，置于冰浴中冷卻2 h，取出后迅速濾過(guò)，放至室溫，取續(xù)濾液10 mL置25 mL 量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 另按處方比例及制備工藝，配制不含苯酚的空白制劑，依供試品溶液制備方法提取制備，作為陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，各進(jìn)樣10 μL，考察供試品中苯酚和其他組分色譜峰分離情況。在此色譜條件下，苯酚的保留時(shí)間為4.8 min，苯酚色譜峰峰形對(duì)稱尖銳，基線平穩(wěn)，與其他色譜峰分離良好，陰性對(duì)照在相應(yīng)位置上無(wú)干擾峰。具體見(jiàn)圖1。

圖1 薄荷苯酚軟膏的HPLC色譜圖A-對(duì)照品，B-供試品，C-陰性對(duì)照；1-苯酚Fig 1 HPLC chromatograms of menthol-phenol ointmentA-reference substance, B-sample, C-negative reference substance;1-phenol

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取適量?jī)?chǔ)備液B，加流動(dòng)相配制成含苯酚濃度為9、18、36、72、180、360 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得苯酚的回歸方程為Y=9.266X+ 5.983，r= 0.999 9。結(jié)果表明，苯酚在9 ～360 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，計(jì)算苯酚的峰面積RSD（n= 6）為0.70%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品（批號(hào)20130515-1）約0.5 g，共6份，精密稱定，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量RSD（n= 6）為0.33%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、1、3、6、9、12 h進(jìn)樣10 μL測(cè)定，計(jì)算苯酚的峰面積RSD為0.33%（n= 6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取6份已知苯酚含量的薄荷苯酚軟膏（批號(hào)20130515-3），每份約0.5 g，精密稱定，每份分別精密加入含苯酚濃度為900 μg·mL-1的溶液5 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定苯酚的含量，并計(jì)算加樣回收率。苯酚的平均回收率為100.2%，RSD為0.68%，詳見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn).n = 6Tab 1 Results of recovery test.n = 6

2.9 樣品含量測(cè)定

取3批樣品（批號(hào)20130515-1、20130515-2、20130515-3），每批3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算各個(gè)樣品中苯酚的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 苯酚含量測(cè)定方法的選擇

苯酚的含量測(cè)定方法主要有溴量法[1]、紫外分光光度法[2-4]、毛細(xì)管氣相色譜法[5]以及高效液相色譜法[6-8]等。由于薄荷苯酚軟膏處方中羊毛脂和薄荷腦對(duì)于溴量法測(cè)定苯酚有干擾[3]；凡士林和羊毛脂在271 nm波長(zhǎng)下有吸收，直接采用紫外分光光度法測(cè)定苯酚會(huì)造成干擾。因此，《解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》（2002年版）其含量測(cè)定時(shí)將本品經(jīng)石油醚溶解后，在氫氧化鈉溶液中多次萃取，將苯酚堿化為苯酚鈉后進(jìn)行測(cè)定，操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，且易因乳化而造成損失，影響結(jié)果的重現(xiàn)性。毛細(xì)管氣相色譜法對(duì)儀器要求較高，而采用HPLC法則可避免基質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾，專屬性強(qiáng)，且儀器較為普及，適用于醫(yī)療單位對(duì)該制劑的質(zhì)量控制。但由于軟膏基質(zhì)凡士林和羊毛脂黏度大，成分復(fù)雜，樣品處理不當(dāng)易造成色譜柱堵塞損壞色譜柱。為此，本研究在參考文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。

表2 薄荷苯酚軟膏中苯酚的含量.n = 3Tab 2 Contents determination of phenol in menthol-phenol ointment.n = 3

3.2 樣品處理方法的優(yōu)化

通過(guò)對(duì)樣品的提取溶劑進(jìn)行考察，本研究發(fā)現(xiàn)無(wú)水乙醇的提取率明顯高于流動(dòng)相，但使用無(wú)水乙醇提取后，提取液用流動(dòng)相稀釋會(huì)析出白色沉淀，直接進(jìn)樣易損壞色譜柱。因此，本研究在樣品提取后，利用冰浴使輔料沉淀，濾過(guò)后加入流動(dòng)相稀釋，再用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)后進(jìn)樣，以減小供試品對(duì)色譜柱的損害[7-10]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，60 ℃水浴時(shí)充分振搖可完全提取樣品，由于60 ℃超聲提取方法相對(duì)簡(jiǎn)便且重現(xiàn)性更好，故采用60 ℃超聲處理作為本實(shí)驗(yàn)的提取方法。

常溫時(shí)薄荷苯酚軟膏黏度大，精密取樣后，較難轉(zhuǎn)移至容量瓶中，易造成樣品損失。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，80 ℃的無(wú)水乙醇可將基質(zhì)軟化，提高基質(zhì)流動(dòng)性，可使樣品完全轉(zhuǎn)移。綜上，結(jié)果表明本方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，可作為薄荷苯酚軟膏中苯酚含量測(cè)定的方法。

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