林小建， 龔如金， 李 平， 于建國(guó)

(華東理工大學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)工程聯(lián)合國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237)

圖1 氨魯米特對(duì)映體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of aminoglutethimide enantiomers

纖維素-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)手性固定相(Chiralcel OD-H)具有很高的對(duì)映體選擇性，且負(fù)載量大，是目前應(yīng)用較廣泛的一種手性固定相［10-12］。本文采用該固定相在正相色譜條件下研究了氨魯米特對(duì)映體的拆分。本文通過測(cè)定氨魯米特在兩種流動(dòng)相體系中的溶解度，優(yōu)選了對(duì)樣品溶解度大的流動(dòng)相體系，并考察了流動(dòng)相添加劑乙醇胺(MEA)對(duì)對(duì)映體拆分的影響。在此基礎(chǔ)上研究了流動(dòng)相中醇含量、柱溫以及進(jìn)樣量對(duì)分離因子、分離度、不對(duì)稱因子和理論板數(shù)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

制備單一對(duì)映體的方法主要有手性合成和手性拆分兩種方法［2，3］。手性合成是以手性物質(zhì)為原料合成其他手性化合物或者在催化劑的作用下合成單一對(duì)映體化合物;手性拆分是指使用特定的拆分劑，利用物理、化學(xué)或生物方法將外消旋體拆分成兩個(gè)單一對(duì)映體。手性色譜拆分法是應(yīng)用最為廣泛的一種手性拆分方法，其中液相色譜拆分法因具有高選擇性、高穩(wěn)定性、高效率等諸多優(yōu)勢(shì)，在手性拆分中占有重要地位，已有多篇采用手性固定相在高效液相色譜中拆分手性化合物的報(bào)道［4-6］。

手性固定相法在高效液相色譜中拆分氨魯米特對(duì)映體國(guó)內(nèi)未見報(bào)道，主要集中于國(guó)外的研究。Ali等［7］使用Chiralpak IA手性柱和Chiralpak IB手性柱，分別以甲基叔丁醚-四氫呋喃(THF)(90∶10，v/v)、100%二氯甲烷和100%乙腈為流動(dòng)相拆分氨魯米特，研究結(jié)果表明Chiralpak IA柱在3種流動(dòng)相中均能拆分氨魯米特對(duì)映體，而Chiralpak IB柱均不能實(shí)現(xiàn)拆分。Aboul-Enein等［8］以正己烷/乙醇(50∶50，v/v)為流動(dòng)相，使用Chiralcel OD柱對(duì)氨魯米特進(jìn)行了拆分，分離因子為1.43。該作者［9］還

1.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)所用Dionex 3000高效液相色譜系統(tǒng)(ThermoFisher，美國(guó))由 U3000二元梯度泵、U3000自動(dòng)進(jìn)樣器、U3000RS柱溫箱、U3000RS紫外檢測(cè)器以及Chromeleon6.8色譜工作站組成。2300TH型超聲儀(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。W5-100SP水浴鍋(上海申生科技有限公司)。手性柱 Chiralcel OD-H(150 mm ×4.6 mm，5 μm)購(gòu)自日本Daicel公司。

氨魯米特外消旋體(純度＞99.0%)購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司;1，3，5-三叔丁基苯(TTBB，純度＞98.0%)購(gòu)自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;正己烷、乙醇、異丙醇(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙醇胺(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 色譜拆分條件

色譜柱為Chiralcel OD-H，流動(dòng)相為30∶70∶0.1(v/v/v)的正己烷/乙醇/乙醇胺，流動(dòng)相使用前超聲脫氣10 min。檢測(cè)器波長(zhǎng)為254 nm;柱溫為25℃;流速為0.6 mL/min;進(jìn)樣體積為20 μL。

1.3 對(duì)映體色譜分離性能評(píng)價(jià)參數(shù)

文中用于評(píng)價(jià)分離性能的參數(shù)如下:異構(gòu)體的保留因子k=(tR-t0)/t0，反映色譜柱對(duì)異構(gòu)體的保留特性;分離因子α=k2/k1，柱選擇性的量度;分離度Rs=2(t2-t1)/(w1+w2)，判斷異構(gòu)體在色譜柱中的分離情況;理論板數(shù)N=5.54(tR/Wh/2)2，定量表示色譜柱的分離效率;不對(duì)稱因子As=W0.05h/2a，描述色譜峰的不對(duì)稱程度。以上各式中，tR為保留時(shí)間，其中t1為弱保留化合物的保留時(shí)間，t2為強(qiáng)保留化合物的保留時(shí)間;t0為色譜柱的死時(shí)間;w1和w2為兩異構(gòu)體的峰寬;Wh/2為半峰高處的峰寬;W0.05h為5%峰高處的峰寬;a為峰極大至5%峰高處的前半峰寬。

1.4 溶解度測(cè)定方法

本文采用重量法［13］測(cè)定氨魯米特外消旋體在流動(dòng)相中的溶解度。實(shí)驗(yàn)方法:首先用相同體積不同組成的流動(dòng)相在玻璃瓶中溶解過量的氨魯米特粉末，將玻璃瓶放至30℃的水浴中恒溫12 h，得到飽和溶液。取500 μL飽和上清液至重量為mV的玻璃瓶中，稱重并記為mVS。將裝有上清液的玻璃瓶放至70℃的烘箱中進(jìn)行溶劑揮發(fā)，直至玻璃瓶重量不再發(fā)生變化，此時(shí)玻璃瓶重量記為mVR。氨魯米特外消旋體在溶劑中的飽和溶解度S(g/kg)可按下式計(jì)算:

2 結(jié)果與討論

2.1 氨魯米特在流動(dòng)相中的溶解度

本實(shí)驗(yàn)所使用的固定相為涂敷型手性固定相，根據(jù)該類手性固定相使用說明書，本文選擇正己烷/乙醇、正己烷/異丙醇作為流動(dòng)相，測(cè)定了氨魯米特外消旋體在這兩種流動(dòng)相體系中的溶解度，結(jié)果見圖2。可以看出，當(dāng)醇含量為0即流動(dòng)相為100%正己烷時(shí)，氨魯米特溶解度為0，說明氨魯米特不溶于正己烷。隨著流動(dòng)相中醇含量的增加，氨魯米特的溶解度不斷增大。比較30℃時(shí)兩種流動(dòng)相體系對(duì)樣品的溶解度可發(fā)現(xiàn)，在醇含量相同的情況下，氨魯米特在正己烷/乙醇中的溶解度高于氨魯米特在正己烷/異丙醇中的溶解度，并且隨著醇含量增加，兩者差值加大;至醇含量達(dá)到100%時(shí)，氨魯米特在乙醇中的溶解度(39.84 g/kg)是異丙醇(14.86 g/kg)的近3倍。在單一對(duì)映體制備過程中，樣品在流動(dòng)相中的溶解度是關(guān)鍵因素，它關(guān)系著制備分離的生產(chǎn)量。本文所選用的正己烷、乙醇、異丙醇對(duì)氨魯米特的溶解度偏低，即使乙醇溶解度較好，在30℃條件下的最大溶解度值也僅為39.84 g/kg，因此在后續(xù)研究過程中，進(jìn)一步優(yōu)化溶劑種類以提高氨魯米特的溶解度是非常重要的。

本文通過Eviews 6.0軟件，采用普通最小二乘法基于截面數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸分析.首先，對(duì)浙江省對(duì)外直接投資的出口效應(yīng)進(jìn)行檢驗(yàn)，回歸結(jié)果如下：

圖2 氨魯米特外消旋體在兩種流動(dòng)相體系中的溶解度Fig.2 Solubility of racemic aminoglutethimide in the two different solvents

此外，以正己烷/乙醇為流動(dòng)相，還考察了溫度對(duì)氨魯米特溶解度的影響，結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯?，溫度越高，氨魯米特在正己烷/乙醇中的溶解度越大，這一現(xiàn)象隨著乙醇含量的增加越發(fā)明顯。可見選擇高溫操作和高醇含量流動(dòng)相更有利于樣品的溶解。然而，由于操作溫度以及流動(dòng)相中醇含量均影響對(duì)映體在固定相上的吸附和分離，因此，本文將綜合考慮這些因素，選擇合適的操作溫度和流動(dòng)相中的乙醇含量。

2.2 流動(dòng)相添加劑對(duì)氨魯米特拆分的影響

流動(dòng)相添加劑一般用來調(diào)整溶質(zhì)保留時(shí)間或改善色譜峰形，它的另一個(gè)重要作用是調(diào)節(jié)體系的pH值，從而建立穩(wěn)定的溶質(zhì)-固定相作用環(huán)境［14］。本文以正己烷/乙醇(30∶70，v/v)為流動(dòng)相，乙醇胺為流動(dòng)相添加劑，比較了不加乙醇胺和添加0.1%(體積分?jǐn)?shù))乙醇胺兩種流動(dòng)相組成下氨魯米特對(duì)映體的拆分效果，色譜圖見圖3。色譜分離后的樣品通過旋光儀(IBZ，德國(guó))測(cè)定旋光度，結(jié)果證明 S-(-)-氨魯米特先出峰，R-(+)-氨魯米特后出峰，出峰順序與文獻(xiàn)［8］一致。從圖3可看出，當(dāng)流動(dòng)相中不添加乙醇胺時(shí)，色譜峰形較差，主峰前面出現(xiàn)了一個(gè)較大的雜峰，推測(cè)這是由于固定相表面殘余硅羥基對(duì)溶質(zhì)的非立體選擇性吸附引起的。當(dāng)流動(dòng)相中添加了0.1%乙醇胺時(shí)，主峰前的雜峰不再存在，主峰的峰形較不添加乙醇胺時(shí)更為“尖銳”，分離效果得到明顯改善。此外，觀察保留時(shí)間可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動(dòng)相中加有0.1%的乙醇胺時(shí)，兩異構(gòu)體的保留時(shí)間均變小，這可能是由于添加劑與溶質(zhì)在固定相的吸附位點(diǎn)上發(fā)生了競(jìng)爭(zhēng)性吸附，從而影響了溶質(zhì)的保留時(shí)間。

圖3 流動(dòng)相添加劑對(duì)氨魯米特手性拆分的影響Fig.3 Effect of mobile phase additive on the enantioseparation of aminoglutethimide

2.3 流動(dòng)相中醇含量對(duì)氨魯米特拆分的影響

以正己烷/乙醇添加0.1%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇胺為流動(dòng)相，在25℃下研究了不同醇含量對(duì)氨魯米特對(duì)映體拆分的影響，色譜柱的死時(shí)間t0由不保留物質(zhì)TTBB測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 流動(dòng)相中乙醇含量對(duì)氨魯米特對(duì)映體拆分的影響Table 1 Effect of the ethanol content in mobile phase on the enantioseparation of aminoglutethimide

由表1可知，隨著流動(dòng)相中乙醇含量的增加，即流動(dòng)相的極性越來越大時(shí)，氨魯米特對(duì)映體的保留時(shí)間、保留因子、選擇性因子和分離度均越來越小。可能有3點(diǎn)原因:第一，隨著流動(dòng)相中乙醇含量的增加，流動(dòng)相的極性變大，不利于氨魯米特在固定相上的吸附，因此對(duì)映體更容易被洗脫下來，保留時(shí)間變的更短;第二，乙醇與固定相之間的氫鍵作用抑制了氨魯米特對(duì)映體與固定相間的作用，流動(dòng)相中乙醇含量的增大引起保留時(shí)間縮短，分離度也變小;第三，隨著乙醇含量的增加，對(duì)映體與手性固定相上的識(shí)別可能也受到抑制，從而導(dǎo)致分離因子的下降。

從制備角度出發(fā)，在保證得到較好分離度的情況下，應(yīng)采用對(duì)樣品溶解度較大的流動(dòng)相［15］，即醇含量高的流動(dòng)相。同時(shí)，必須考慮到乙醇黏度較大，乙醇含量太高會(huì)造成系統(tǒng)壓力過高，特別是對(duì)多柱串聯(lián)的模擬移動(dòng)床色譜而言，過高的系統(tǒng)壓力會(huì)對(duì)設(shè)備提出更高的要求。因此本文最終確定的流動(dòng)相組成是正己烷/乙醇/乙醇胺體積比為30∶70∶0.1。

2.4 柱溫對(duì)氨魯米特拆分的影響

本文以Chiralcel OD-H手性柱為固定相，正己烷/乙醇/乙醇胺(30∶70∶0.1，v/v/v)為流動(dòng)相，流速為0.6 mL/min，研究了25～40℃范圍內(nèi)溫度對(duì)氨魯米特拆分的影響，結(jié)果見表2。

從表2可知，隨著溫度的升高，保留時(shí)間、分離度明顯下降，分離因子變化很小，說明溫度對(duì)對(duì)映體選擇性的影響很小。通常在低溫條件下，對(duì)映體與手性固定相形成的配合物較高溫條件時(shí)更加穩(wěn)定，更不易被洗脫下來，有利于保留和提高分離因子，但也有文獻(xiàn)報(bào)道了分離因子隨柱溫升高而升高或基本保持不變的，這主要跟固定相的種類有關(guān)［16，17］。理論板數(shù)隨溫度升高而增加，這是因?yàn)樯郎赜欣跀U(kuò)散傳質(zhì)，從而提高色譜柱柱效。結(jié)合溶解度實(shí)驗(yàn)和柱溫實(shí)驗(yàn)結(jié)果，溫度升高雖有利于樣品的溶解，但不利于對(duì)映體在固定相上的吸附和分離，而且工業(yè)生產(chǎn)中在較高溫度下操作勢(shì)必會(huì)增加能耗，增加生產(chǎn)成本。因此，本文選擇25℃為合適的操作溫度。

表2 柱溫對(duì)氨魯米特對(duì)映體拆分的影響Table 2 Effect of column temperature on the enantiomeric separation

綜上所述，本文確定的最佳拆分條件是Chiralcel OD-H 為固定相，30∶70∶0.1(v/v/v)的正己烷/乙醇/乙醇胺為流動(dòng)相，柱溫25℃。在0.6 mL/min的流速下拆分氨魯米特對(duì)映體，分離因子為1.43，分離度可達(dá)2.94，理論板數(shù)超過4 000。與前言報(bào)道的文獻(xiàn)相比，Ali等［7］在Chiralpak IA柱中實(shí)現(xiàn)了氨魯米特的拆分，選用的3組流動(dòng)相的分離因子(3.52，2.32，1.88)較本文更高;Aboul-Enein 等［8］采用的分離體系的分離因子(1.43)雖與本文相近，但異構(gòu)體保留時(shí)間長(zhǎng)達(dá)為16.02 min和20.46 min，不利于分析和制備，且采用的流動(dòng)相中醇含量為50%，樣品在流動(dòng)相中的溶解度偏低;文獻(xiàn)［9］選用的分離體系對(duì)氨魯米特對(duì)映體的分離度僅為0.68，不能實(shí)現(xiàn)氨魯米特的拆分。因此，本研究采用的方法具有簡(jiǎn)便、快速、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)從制備角度優(yōu)選了流動(dòng)相組成，為制備分離提供了參考數(shù)據(jù)。

2.5 進(jìn)樣量對(duì)氨魯米特拆分的影響

本文在上述最佳色譜條件下，又研究了進(jìn)樣濃度對(duì)對(duì)映體拆分的影響。根據(jù)樣品在流動(dòng)相中的溶解度，本研究選用的氨魯米特外消旋體質(zhì)量濃度分別為 2.00、4.90和 10.30 g/L，進(jìn)樣體積均為 20 μL，得到的手性拆分色譜圖如圖4所示，相關(guān)色譜參數(shù)見表3。

從表3可看出，隨著進(jìn)樣濃度的增大，兩異構(gòu)體的保留時(shí)間均減小，說明氨魯米特對(duì)映體在固定相上的吸附行為可用非線性等溫線來描述。分離度和理論板數(shù)隨進(jìn)樣濃度增大均減小，這是由于隨著濃度增大，對(duì)映體不僅與流動(dòng)相和固定相表面分子相互作用，同時(shí)與另一對(duì)映體之間還發(fā)生相互作用，從而影響了分離度和分離效率。而分離因子并未隨進(jìn)樣濃度增大發(fā)生改變，且數(shù)值均較大，說明選擇性高，本文優(yōu)選的分離體系適合用于拆分氨魯米特對(duì)映體。對(duì)映體色譜峰的不對(duì)稱因子隨濃度增大而增大，說明體系在濃度越高的條件下非線性越強(qiáng)，此時(shí)，溶液中兩對(duì)映體之間的相互作用不能忽略，有時(shí)甚至?xí)蔀橛绊懓濒斆滋夭鸱值闹饕蛩亍?/p>

圖4 不同進(jìn)樣濃度下氨魯米特的手性分離色譜圖Fig.4 Enantioseparation chromatograms of aminoglutethimide at different injection concentrations

表3 進(jìn)樣濃度對(duì)氨魯米特手性拆分的影響Table 3 Effect of injection concentration on enantioseparation of aminoglutethimide

對(duì)于制備分離，色譜柱的最大負(fù)載量是提高生產(chǎn)能力的重要參數(shù)，它與進(jìn)樣濃度和進(jìn)樣體積有關(guān)，由溶質(zhì)在固定相上的吸附平衡決定。本工作在氨魯米特溶解度允許范圍內(nèi)，選取高進(jìn)樣濃度，總進(jìn)樣質(zhì)量濃度為10.42 g/L，在最佳拆分條件下研究了進(jìn)樣體積對(duì)對(duì)映體分離的影響，得到的色譜圖如圖5所示，相關(guān)色譜分離結(jié)果見表4。

表4 進(jìn)樣體積對(duì)氨魯米特色譜拆分的影響Table 4 Effect of injection volume on enantioseparationof aminoglutethimide

從表4可以看出，隨著進(jìn)樣體積的不斷增大，氨魯米特對(duì)映體的分離度不斷減小，對(duì)映體色譜峰發(fā)生展寬(見圖5)。而進(jìn)樣體積對(duì)分離因子的影響較小，分離因子基本不變，說明進(jìn)樣量對(duì)選擇性影響很小。當(dāng)進(jìn)樣體積為100 μL時(shí)，分離度為1.58，滿足基線分離的要求。加大進(jìn)樣體積至200 μL，分離度下降至1.13，繼續(xù)增大進(jìn)樣體積將不能實(shí)現(xiàn)對(duì)映體的分離。

3 結(jié)語(yǔ)

圖5 不同進(jìn)樣體積下氨魯米特的手性分離色譜圖Fig.5 Enantioseparation chromatograms of aminoglutethimide at different injection volumes

以纖維素-三(3，5-二甲苯基氨基甲酸酯)為固定相，正己烷/乙醇/乙醇胺為流動(dòng)相，在高效液相色譜中實(shí)現(xiàn)了氨魯米特對(duì)映體的拆分，拆分效果良好。通過實(shí)驗(yàn)確定的最佳拆分條件如下:流動(dòng)相為正己烷/乙醇/乙醇胺(體積比為 30∶70∶0.1)，柱溫為 25℃，流速為0.6 mL/min，分離度可達(dá)2.94，理論板數(shù)超過4 000。研究發(fā)現(xiàn)，在高濃度進(jìn)樣條件下，氨魯米特在固定相上的吸附行為呈非線性，這在制備分離中可能成為影響氨魯米特拆分的主要因素。因此，進(jìn)一步測(cè)定高濃度的非線性吸附平衡具有重要意義。本研究所得結(jié)果可為工業(yè)化放大提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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