馮慧 王亞雷 陳熹 張辰宇 袁耀宗 姚瑋艷

近年來微小核糖核酸(microRNA, miRNA)在腫瘤的診斷和治療中的作用越來越受到關(guān)注，其中循環(huán)miRNA的發(fā)現(xiàn)為胰腺癌的早期診斷提供了極大的契機(jī)，同時(shí)也為研究胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的可能分子機(jī)制提供了全新的思路和途徑。但是在胰腺癌中，循環(huán)miRNA是如何產(chǎn)生、如何穩(wěn)定存在的，其生物學(xué)功能又是什么，這一系列的問題還有待闡明。本研究采用梯度離心法分離人胰腺癌細(xì)胞系培養(yǎng)上清、健康人群和胰腺癌患者血清中的微囊泡(microvesicle，MV)，了解細(xì)胞培養(yǎng)上清及血清中的MV是否包含循環(huán)的miRNA，探討循環(huán)miRNA的載體。

材料和方法

一、血清MV的分離

采集6例病理證實(shí)的尚未行手術(shù)治療、放療及化療的胰腺導(dǎo)管腺癌患者外周血，以6例同年齡段健康體檢者的外周血作為對照組。加入3.8%的檸檬酸鈉溶液抗凝后上下混勻，室溫1 000 r/min離心10 min后取上層血漿，然后4℃ 300 g/min離心5 min去除殘留血細(xì)胞，4℃ 1 500 g/min離心20 min去除血小板及其他細(xì)胞碎片，4℃ 3 000 g/min離心30 min去除殘存細(xì)胞器，最后4℃ 110 000 g/min離心70 min棄上清，沉淀即為血清的MV。用500 μl PBS反復(fù)吹打溶解后置4℃保存。同時(shí)將含有游離miRNA的上清4℃保存。

二、細(xì)胞培養(yǎng)上清的MV分離

胰腺癌SW1990、BxPC3細(xì)胞系由上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室饋贈，常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d傳代。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，室溫1 000 r/min離心5 min后取上清，然后4℃ 3 000 g/min離心30 min，4℃ 110 000 g/min離心70 min棄上清，沉淀即為細(xì)胞培養(yǎng)上清的MV。用500 μl PBS反復(fù)吹打溶解后置4℃保存。

三、miRNA水平檢測

采用酸性酚法提取血清miRNA，采用Trizol(Invitrogen公司)提取細(xì)胞培養(yǎng)上清和血清MV中miRNA。應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR法檢測miRNA水平。PCR反應(yīng)體系：Taq酶0.33 μl，cDNA 1 μl，MgCl21.2 μl，dNTP mixture(2.5 mmol/L) 1.6 μl，10×PCR buffer 2 μl， TaqMan probe+primer 1 μl，ddH2O 12.5 μl；反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 15 s、60℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)，最后60℃延伸5 min。通過儀器自帶軟件獲取Ct值，通過公式2-ΔΔCt計(jì)算miRNA的水平。

四、MV的Ago2、CD63蛋白水平檢測

分離的血清MV直接用裂解液裂解，細(xì)胞培養(yǎng)上清MV用預(yù)冷的PBS洗滌2次后加入預(yù)冷的裂解緩沖液冰上裂解30 min，其間用槍吹打幾次，12 000 g離心15 min取上清，BCA法定量蛋白后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex、RISC)的核心元件Ago2蛋白及MV的標(biāo)志性糖蛋白CD63的水平。兔抗人Ago2、CD63抗體購自Abcam公司，工作濃度分別為1∶200及1∶400，羊抗兔IgG購自Santa Cruz公司，工作濃度1∶1 500。最后ECL發(fā)光，X線曝光、顯影、定影。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺癌細(xì)胞和培養(yǎng)上清MV的Ago2、CD63蛋白表達(dá)水平

為了解所離心物質(zhì)是否為MV，本研究檢測胰腺癌細(xì)胞及其培養(yǎng)上清MV的Ago2、CD63蛋白。結(jié)果它們均表達(dá)Ago2、CD63蛋白(圖1)。

圖1 SW1990、 BxPC3(1、3)細(xì)胞及其培養(yǎng)上清MV(2、4)的Ago2、CD63蛋白表達(dá)

二、SW1990、 BxPC3培養(yǎng)上清MV包裹的和游離的(MV-free)miRNA水平

參考文獻(xiàn)[1-2]，本研究檢測胰腺癌患者血清中顯著升高的10個(gè)miRNA水平。兩株細(xì)胞培養(yǎng)上清中均存在MV包裹的miRNA及游離的miRNA，但其含量存在較大差異(圖2)。

圖2 SW1990(a)、BxPC3(b) 培養(yǎng)上清MV內(nèi)包裹的和游離的miRNA表達(dá)量

三、胰腺癌患者血清MV包裹的和游離的miRNA水平

選擇6個(gè)在胰腺癌患者血清中含量相對較高的miRNAs(miR-20a、miR-21、miR-24、miR-25、miR-191、miR-483-5p)進(jìn)行研究[1-2]。胰腺癌組、對照組的血清及MV中均存在miR-20a、miR-21、miR-24、miR-25、miR-191、miR-483-5p(圖3)，但以MV包裹的量較多，且胰腺癌組MV包裹的miRNA量與對照組不完全一致，miR-20a、miR-24、miR-191分別為對照組的(2.93±0.29)、(2.73±0.46)、(2.39±0.51)倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為75.97、25.80、12.94，P<0.05或<0.01，圖4)。

圖3 對照組(NC)和胰腺癌患者(PDAC)血清中miRNA的水平

圖4 對照組(NC)和胰腺癌患者(PDAC)血清中MV包裹的和游離的(MV-free)miRNA含量

討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNAs與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。miRNAs是19～25個(gè)核苷酸、非蛋白質(zhì)編碼的小RNA家族，通過與靶miRNA3′端的非編碼區(qū)結(jié)合，降解或者抑制mRNA的翻譯，導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默，從而參與靶基因功能的調(diào)節(jié)。癌相關(guān)性miRNA可以在腫瘤患者的周圍循環(huán)中檢測到。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，在食道癌[3]、肺癌[4]、乳腺癌[5]、彌漫性B細(xì)胞淋巴瘤[6]、前列腺癌[7]等疾病中，循環(huán)miRNA可作為臨床診斷和預(yù)后評估的分子標(biāo)志物。Liu等[1]通過對血清和組織中的miRNA比較，得出血清中的miRNA來源于腫瘤細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)7種miRNA(miRNA20a、miRNA21、miRNA 24、miRNA 25、miRNA 99a、miRNA 185、miRNA 191)聯(lián)合檢測可以區(qū)別胰腺癌、慢性胰腺炎以及正常健康者，且這7種miRNA在早期病變時(shí)就有變化。在26例Ⅰ期胰腺癌患者中，聯(lián)合診斷率為96.2%，在48例Ⅱ期胰腺癌患者中，聯(lián)合診斷率達(dá)91.7%。

MV是機(jī)體內(nèi)細(xì)胞在正常和病理狀態(tài)下都會分泌的直徑在30～1 000 nm之間的膜結(jié)構(gòu)小體，包括exosome和shedding vesicle兩種[8-9]。紅細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞均能分泌MV。細(xì)胞把特異的生物活性分子如蛋白質(zhì)等包裹到MV中，這些生物活性分子通過MV被運(yùn)輸?shù)较鄳?yīng)的受體細(xì)胞并調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物功能，這種由MV介導(dǎo)的細(xì)胞間信息傳遞在一些生理和病理過程中起著十分重要的作用[8-9]。

Ogawa等[10]應(yīng)用miRNA芯片分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)源自脂肪細(xì)胞的MV中也富含大量的miRNA，同時(shí)脂肪細(xì)胞分泌的miRNA會調(diào)控其靶細(xì)胞巨噬細(xì)胞的成熟和分化。Collino等[11]發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞分泌的MV中包裹的miRNA會調(diào)控小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)多個(gè)與其生理過程密切相關(guān)的基因的表達(dá)。而Sun等[12]在分泌miRNA領(lǐng)域的后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，牛奶中富含的免疫相關(guān)miRNA會通過MV行使免疫調(diào)節(jié)功能。為了解血清中miRNA作用途徑及是否存在相應(yīng)載體，他們通過梯度離心法分離血清和T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中的MV，發(fā)現(xiàn)血清及細(xì)胞培養(yǎng)上清中的MV包含miRNA，并且MV可能是循環(huán)miRNA的主要載體[13]。本研究通過梯度離心方法胰腺癌細(xì)胞系SW1990、BxPC3培養(yǎng)上清及胰腺癌患者及對照組上清中的MV，它們均含有外核體表面的標(biāo)志性蛋白CD63及miRNA行使功能的蛋白Ago2，并且這些MV富含miRNA。表明MV是miRNA最主要的載體。進(jìn)一步檢測胰腺癌患者和對照組血清miRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-20a、miR-24、miR-191在胰腺癌患者血清中表達(dá)較對照組顯著升高，而且血清中的miRNA絕大部分被包裹在MV中。胰腺癌患者與對照組血清MV包裹的miRNA不同，且包裹的量也不同，有些游離的miRNA量較MV包裹的高，這可能與在不同的生理或疾病狀態(tài)下MV選擇性包裹miRNA相關(guān)。這種選擇性的包裹是細(xì)胞主動地、特異性地分泌miRNA的基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)

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