商建 鄒金艷 伍威 易三鳳 張海平 林軍

Hedgehog信號通路成員主要包括Hedgehog配體、PTCH受體、SMO受體、轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白及位于下游的其他相關(guān)信號分子[1]。維生素D3又名煙堿酸胺、膽骨化醇，在鈣磷代謝中發(fā)揮重要作用。Garland等[2]發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)的腫瘤發(fā)生率與該地區(qū)所接受的日照成反比，該差異可能與維生素D3水平有關(guān)。近年來有研究報道維生素D3可通過阻斷Hedgehog信號通路發(fā)揮抗瘤效應(yīng)[3-5]。本研究應(yīng)用不同濃度維生素D3干預(yù)胰腺癌PANC1細胞系，檢測細胞增殖、凋亡及PTCH、Gli-1基因表達的變化，探討維生素D3通過阻斷Hedgehog信號通路抗胰腺癌的作用機制。

材料與方法

一、細胞增殖檢測

人胰腺癌PANC1細胞系購自中國科學(xué)院上海細胞庫常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對數(shù)生長期細胞，接種于96孔板，每孔104個細胞。應(yīng)用25、50、75、100 μmol/L的維生素D3干預(yù)PANC1細胞24、48、72 h，以未加維生素D3處理的細胞作為陰性對照組，以未接種細胞作為空白對照組，每組均設(shè)5個復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h，然后每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，每孔加入100 μl DSMO震蕩5 min，上酶標儀檢測波長為570 nm處的吸光度值(A570值)，計算細胞抑制率。細胞抑制率=[1-(實驗組A570值-空白組A570值)/(陰性對照組A570值-空白組A570值)]×100%。實驗重復(fù)3次，取均值。

二、細胞凋亡檢測

同上述的細胞分組培養(yǎng)24 h，收集細胞。按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

三、PTCH、Gli-1 mRNA表達量檢測

同上述的細胞分組培養(yǎng)24 h，收集細胞，同時應(yīng)用75 μmol/L的維生素D3干預(yù)PANC1細胞0、12、24、36、48 h，收集各時間點細胞。采用Trizol提取細胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進行PCR擴增。PCR引物序列：PTCH正義引物5′-TCTCGGATCATTGTGATGGA-3′，反義引物5′-AGGCTCAGCACTAGGCATGT-3′，擴增產(chǎn)物104 bp；Gli-1正義引物5′-CTGGATCGGATAGGTGGTCT-3′，反義引物5′-CAGAGGTTGGGAGGTAAGGA-3′，擴增產(chǎn)物226 bp；內(nèi)參GAPDH正義引物5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，反義引物5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′，擴增產(chǎn)物496 bp。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)程序：95℃ 5 min，95℃ 30 s、58℃(PTCH)或61℃(Gli-1)或58℃(GAPDH)30 s、72℃ 40 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示mRNA相對表達量。實驗重復(fù)3次，取均值。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、維生素D3干預(yù)對胰腺癌PANC1細胞增殖的影響

維生素D3干預(yù)24 h不影響PANC1細胞的增殖；干預(yù)48 h后，PANC1細胞的生長隨維生素D3濃度的增加而被抑制，其中50、75、100 μmol/L組與陰性對照組，100 μmol/L組與25、50 μmol/L組之間的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)；干預(yù)72 h后，PANC1細胞的生長亦隨維生素D3濃度的增加而被抑制，其中75、100 μmol/L組與陰性對照組及25、50 μmol/L組之間的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。干預(yù)48 h的各濃度組細胞生長抑制率均較干預(yù)24 h同濃度組升高，而干預(yù)72 h的各濃度組細胞生長抑制率均較干預(yù)24 h同濃度組降低(表1)。

表1 維生素D3干預(yù)后PANC1細胞增殖的變化

二、維生素D3干預(yù)對胰腺癌PANC1細胞凋亡的影響

陰性對照組PANC1細胞的早期凋亡率為(5.89±0.57)%；維生素D3干預(yù)24 h后， 25、50、75、100 μmol/L組PANC1細胞的早期凋亡率分別為( 6.06±0.44)%、(16.21±1.62)%、(16.94±0.91)% 、(20.96±0.98)%，早期凋亡率隨濃度的增加而增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=142.062，P<0.05)，其中50、75、100 μmol/L組與陰性對照組、25 μmol/L組之間，100 μmol/L與50、75 μmol/L組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05，圖1)，以100 μmol/L的效果最佳。

三、維生素D3干預(yù)后PANC1細胞PTCH、Gli-1 mRNA表達的變化

不同濃度維生素D3作用PANC1細胞24 h后，陰性對照組及25、50、75、100 μmol/L組細胞的PTCH mRNA表達量分別為0.117±0.009、0.104±0.011、0.069±0.011、0.052±0.009、0.056±0.007，隨濃度的增加而下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=27.279，P<0.05，圖2)，其中50、75、100 μmol/L組與陰性對照組、25 μmol/L組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)；75 μmol/L維生素D3干預(yù)0、12、24、36、48 h后，PTCH mRNA表達量分別為0.142±0.008、0.127±0.009、0.111±0.010、0.115±0.003、0.102±0.007，隨時間的延長而下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.602，P<0.05)，其中12、24、36、48 h點與0 h點之間，24、48 h點與12 h點之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。

D1象限代表測量誤差，D2象限代表中晚期凋亡細胞，D3象限代表正常細胞，D4象限代表早期凋亡細胞

圖1陰性對照組(1a)及維生素D3 25(1b)、50(1c)、75(1d)、100 μmol/L(1e)組PANC1的凋亡細胞

不同濃度維生素D3作用24 h后，陰性對照組及25、50、75、100 μmol/L組細胞的Gli-1 mRNA表達量分別為0.323±0.007、0.312±0.015、0.299±0.015、0.233±0.007、0.175±0.014，隨濃度的增加而下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=74.653，P<0.05，圖2)，其中50、75、100 μmol/L組與陰性對照組之間，75、100 μmol/L與25、50 μmol/L組之間，100 μmol/L與75 μmol/L組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)；75 μmol/L維生素D3干預(yù)0、12、24、36、48 h后，Gli-1 mRNA 分別為0.341±0.011、0.317±0.017、0.320±0.018、0.226±0.011、0.191±0.010，隨時間的延長而下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=66.465，P<0.05，圖2)，其中36、48 h點與0、12、24 h點之間，48 h點與36 h點之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。

圖2 不同濃度(0、25、50、75、100 μmol/L)維生素D3干預(yù)PANC1細胞24 h(上)及75 μmol/L維生素D3干預(yù)PANC1細胞不同時間(0、12、24、36、48 h)后(下)PTCH mRNA(左)及Gli-1 mRNA(右)表達量

討 論

胰腺癌的惡性程度極高，是人類21世紀急需攻破的難題。 傳統(tǒng)治療(手術(shù)、放療、化療以及綜合治療)并不能完全有效地緩解癥狀，只有充分了解胰腺癌發(fā)病的分子生物學(xué)機制才能更好地預(yù)防、診斷和治療疾病。胰腺癌的發(fā)病主要涉及原癌基因、抑癌基因及基因組維護基因的異常[6]，它們通過一條或多條信號通路引起細胞不斷惡化，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。常見的信號通路包括TGF-β/SMAD、Wnt/β-Catenin、IGF、Notch、Ras/RAF/MAPK、NF-κB和Hedgehog信號通路[7]，其中Hedgehog信號通路是近些年研究的熱點。近年研究報道，阻滯Hedgehog信號通路可有效抑制胰腺癌的增殖浸潤和惡性進展[8]，具有較強的抗胰腺癌作用。

維生素D3是一種新近發(fā)現(xiàn)的Hedgehog通路阻滯劑。Bijlsma等[3]在2006年首先提出了維生素D3與Hedgehog信號通路的關(guān)系，維生素D3通過直接和smo受體結(jié)合抑制下游信號。Tang等4]研究表明維生素D3通過Hedgehog信號通路抑制小鼠基底細胞癌的增殖。Baek等[5]發(fā)現(xiàn)維生素D3可使胃癌及膽管癌細胞系中Ptch1、Gli、CCND1、Bcl2等基因的表達下調(diào)，并與其他的抗腫瘤藥物有協(xié)同作用。

本研究結(jié)果顯示，不同濃度維生素D3干預(yù)后，胰腺癌PANC1細胞的增殖受到不同程度的抑制，且以較大劑量更為明顯(75、100 μmol/L)。同時，本研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)48 h時的細胞生長抑制較24 h時明顯上升，但72 h時的抑制率反而降低，其原因可能因48h后維生素D3的藥效已衰弱，而殘留的癌細胞開始繼續(xù)增殖，甚至有的癌細胞已進入新的細胞周期開始旺盛的繁殖所致。本研究結(jié)果還顯示，維生素D3可以有效促進PANC1細胞的早期凋亡，在較大濃度組(100 μmol/L)的凋亡率增加更顯著；呈濃度和時間依賴性下調(diào)PTCH、Gli-1 mRNA的表達，表明維生素D3通過抑制Hedgehog信號通路中PTCH、Gli-1基因的表達而有效抑制胰腺癌PANC1細胞的增殖，促進細胞的凋亡，發(fā)揮抗胰腺癌作用。

參 考 文 獻

[1] Nakamura M, Tanaka H, Nagayoshi Y, et al. Targeting the hedgehog signaling pathway with interacting peptides to Patched-1[J]. J Gastroenterol,2012,47(4):452-460.

[2] Garland CF, Garland FC, Gorham ED, et al. The role of vitamin D in cancer prevention[J]. Am J Public Health,2006,96(2):252-261.

[3] Bijlsma MF, Spek CA, Zivkovic D, et al. Repression of smoothened by patched-dependent (pro-)vitamin D3 secretion[J]. PLoS Biol,2006,4(8):e232.

[4] Tang JY, Xiao TZ, Oda Y, et al. Vitamin D3 inhibits hedgehog signaling and proliferation in murine Basal cell carcinomas[J]. Cancer Prev Res (Phila),2011,4(5):744-751.

[5] Baek S, Lee YS, Shim HE, et al. Vitamin D3 regulates cell viability in gastric cancer and cholangiocarcinoma[J]. Anat Cell Biol,2011,44(3):204-209.

[6] Sakorafas GH, Tsiotos GG. Molecular biology of pancreatic cancer: potential clinical implications[J]. BioDrugs,2001,15(7):439-452.

[7] Vaccaro V, Melisi D, Bria E, et al. Emerging pathways and future targets for the molecular therapy of pancreatic cancer[J]. Expert Opin Ther Targets,2011,15(10):1183-1196.

[8] Feldmann G, Dhara S, Fendrich V, et al. Blockade of hedgehog signaling inhibits pancreatic cancer invasion and metastases: a new paradigm for combination therapy in solid cancers[J]. Cancer Res,2007,67(5):2187-2196.