趙暉 鐘衛(wèi)一 韋惠琴 黃滟添

硫氧還蛋白-2(thioredoxin-2, Trx-2)是存在于細(xì)胞線粒體的一種氧化還原蛋白，研究顯示Trx-2在阻止線粒體氧化應(yīng)激方面較Trx-1更具重要作用[1]。為此，本研究檢測Trx-2在急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠肺的表達(dá)，探討Trx-2在對抗肺氧化應(yīng)激方面的作用。

一、材料與方法

1．實驗動物及分組：健康雄性SD大鼠48只,清潔級,體質(zhì)量200～250 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。所有大鼠造模前禁食12 h，自由飲水。按完全隨機(jī)法分成ANP組和對照組，每組各24只。采用腹腔注射6%左旋精氨酸(Sigma公司)25 ml/kg體質(zhì)量、每次間隔1 h、共3次的方法制備ANP模型。對照組大鼠則腹腔注射等容積生理鹽水。術(shù)后6 、12 、24 h分別處死8只大鼠，留取動脈血、胰腺和肺組織標(biāo)本待測。

2．胰腺和肺組織病理學(xué)檢查：胰腺和肺組織常規(guī)固定、石蠟包埋、切片及HE染色。光鏡下觀察大鼠胰腺病理改變,參考Kusske等[2]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。

3．血清谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)測定：GSH、MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所，按說明書操作。

4．Trx-2表達(dá)檢測：采用Elivison二步法檢測肺組織Trx-2表達(dá)。兔抗鼠多抗購自北京生物合成及生物技術(shù)公司，工作濃度1∶200；生物素化羊抗兔二抗來自即用型免疫組化Elivision plus廣譜試劑盒。以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知表達(dá)Trx-2的乳腺癌組織作為陽性對照。應(yīng)用Leica圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量灰度掃描，求出給定面積內(nèi)的灰度值。染色愈深、灰度值愈小，則表示蛋白表達(dá)愈強(qiáng)。

二、結(jié)果

1．胰腺及肺組織病理變化：對照組大鼠胰腺肉眼觀無明顯變化；鏡下見胰腺腺泡結(jié)構(gòu)完整，腺小葉清晰，偶見水腫或少量炎性細(xì)胞浸潤。ANP組大鼠胰腺外觀呈灰白或暗紫色，腹腔內(nèi)有淡黃色或血性腹水，可見部分腹腔臟器粘連、脂肪皂化；鏡下見胰腺腺泡水腫，炎性細(xì)胞浸潤，組織壞死出血，腺小葉結(jié)構(gòu)消失，偶見灶狀或大片凝固性壞死，并隨時間延長而加重(表1)。

對照組大鼠肺臟肉眼觀無明顯變化；鏡下見肺組織結(jié)構(gòu)完整，偶見水腫或少量炎性細(xì)胞浸潤。ANP組大鼠鏡下見肺泡出血、水腫，間質(zhì)出血、水腫，炎性細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管淤血，甚至出現(xiàn)灶性或片狀肺不張，并隨時間延長而加重(表1)。

2．血清GSH、MDA水平的變化：ANP組大鼠血清GSH水平隨時間延長而逐漸下降，各時點均較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；ANP組血清MDA水平隨時間延長而逐漸上升，各時點均較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1 兩組大鼠各指標(biāo)的比較

3．肺組織Trx-2表達(dá)的變化：ANP組6、12 h的肺組織Trx-2表達(dá)強(qiáng)度與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，24 h點表達(dá)強(qiáng)度顯著增高，與對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表1、圖1) 。

圖1 對照組(1a)、ANP組(1b) 24 h點肺組織Trx-2表達(dá)(免疫組化×100)

討論硫氧還蛋白是一個廣泛分布的氧化還原蛋白，通過二硫化物活性中心可逆地催化許多氧化還原反應(yīng)，參與機(jī)體多種生物學(xué)活動，目前發(fā)現(xiàn)的Trx有Trx-1、Trx-2、Trx-14和Trx-80。研究表明，Trx-1和Trx-2過量表達(dá)協(xié)同阻止多種炎性因子(TNF、ROS、ASK1)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[3]。最近研究揭示，線粒體在細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而Trx-2在參與線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑、阻止線粒體膜的去極化、維持膜電位等方面較Trx-1更有效[1]。它們對氧化應(yīng)激保護(hù)作用的差異可能是與其表達(dá)部位不同有關(guān)。Trx-2在線粒體中表達(dá)，而Trx-1在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，因此，Trx-2可以直接阻止線粒體膜的去極化[4]。Umasuthan等[5]研究表明，Trx-2是一種針對抗菌反應(yīng)的強(qiáng)效抗氧化劑。

與Trx-1比較，Trx-2的結(jié)構(gòu)存在一個額外的N-末端結(jié)構(gòu)域，它包含兩個高度保守的CXXC( Cys Xaa Xaa Cys)氨基酸序列結(jié)構(gòu)，這兩個CXXC結(jié)構(gòu)緊密協(xié)調(diào)一個鋅原子，組成鋅中心，氧化時鋅被釋放，通過釋放鋅引發(fā)主要構(gòu)象變化，發(fā)揮氧化還原開關(guān)的作用[6]。Trx-2鋅結(jié)合蛋白的特點是鋅極端的親和力，它遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于已報道的其他鋅結(jié)合蛋白的親和常數(shù)，因此，這種鋅結(jié)合蛋白顯得更加穩(wěn)定[7]。Ritz等[8]研究顯示，體內(nèi)氧化應(yīng)激早期時，所有Trx-2的半胱氨酸處于還原狀態(tài)，并不反映活性氧的存在。他們認(rèn)為Trx-2功能可相當(dāng)于Trx-1 ，在氧化應(yīng)激條件下可能作為一個備份系統(tǒng)發(fā)揮作用。

本課題組先前的研究結(jié)果顯示，在ANP早期肺組織Trx-1表達(dá)即顯著升高[9]。本結(jié)果顯示Trx-2在肺組織的表達(dá)在早期并不升高，而在晚期隨著氧化應(yīng)激反應(yīng)的加重(表現(xiàn)為血GSH持續(xù)降低，MDA持續(xù)升高)時才顯著升高，與Ritz等[8]的結(jié)果相一致，表明Trx-2可能作為一個備用系統(tǒng)參與肺的氧化應(yīng)激反應(yīng)。Trx-2在氧化應(yīng)激的早期表達(dá)不高，除與Trx-2鋅結(jié)合蛋白極端親和力的特征外，還可能與Trx-1表達(dá)增高,減少氧化應(yīng)激有關(guān)[10]。

參 考 文 獻(xiàn)

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