陳思禮, 張 磊, 劉炳君

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 武漢 430074)

毒素-抗毒素系統(tǒng)最初是在大腸桿菌的低拷貝質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)[1]，此系統(tǒng)也是引發(fā)細胞程序性死亡(PCD)的一個重要途徑[2,8].本文中T-A系統(tǒng)基因?qū)κ俏挥隰~腥藻PCC7120的α質(zhì)粒上的一對基因，通過NCBI中BLAST比對后發(fā)現(xiàn)目的基因編碼的蛋白質(zhì)與大腸桿菌中的ParD/E毒素-抗毒素基因?qū)幋a蛋白同源, 而ParD/E毒素抗毒素系統(tǒng)是R1質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的分別編碼毒素蛋白Kid和抗毒素蛋白Kis的基因?qū)3,4]，此毒素-抗毒素基因?qū)υ贓.coli的R1質(zhì)粒上被發(fā)現(xiàn)[3,4]，且ParE毒素基因與F質(zhì)粒上的Ccd毒素抗毒素系統(tǒng)中的CcdB毒素基因具有高度同源性[5,6]，ParE和CcdB編碼蛋白的作用目標(biāo)均為DNA螺旋酶,在DNA的復(fù)制階段破壞DNA雙鏈起到其毒素蛋白的作用[5]，故推斷其編碼的蛋白具有與毒素-抗毒素作用相似的活性功能.并以此作為本文的理論基礎(chǔ).

本文分別克隆了all7155和asl7156基因，再將目的基因片段插入已雙酶切的帶有組氨酸標(biāo)簽的表達載體PET30a(+)中，用以構(gòu)建表達載體,并加入IPTG進行目的蛋白誘導(dǎo)表達，通過SDS-PAGE電泳初步檢測.為進一步研究all7155/asl7156的毒素抗毒素基因?qū)Φ南嗷プ饔锰峁┝艘欢ǖ难芯炕A(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚腥藻sp.PCC7120(中國科學(xué)院水生物研究所)，pMD18-T Vector(Takara公司)，E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)，表達載體pET30a(+)為本實驗室保存．DNA聚合酶(Fermentas公司)，限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶(Takara公司)，瓊脂糖凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Axygene產(chǎn)品)，PCR引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)，克隆片段測序(南京金斯瑞生物科技有限公司測序確定).

1.2 分子生物學(xué)操作

參照分子克隆實驗指南[10]提取PCC7120質(zhì)粒，以其為模板，以all7155-F和all7155-R為引物(見表1), PCR擴增all7155基因片段；以asl7156-F和asl7156-R為引物(見表1)，PCR擴增asl7156基因序列片段.引物中添加BamH I和Hind III酶切位點，PCR擴增產(chǎn)物純化后與pMD18-T Vector載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，藍白斑篩選陽性克隆酶切鑒定測序正確后保存質(zhì)粒，分別命名為pMD18-T-7155和pMD18-T-7156.

表1 PCR引物序列

1.3 構(gòu)建重組表達載體

利用BamH I和Hind III雙酶切質(zhì)粒pET30a, pMD18-T-7155和pMD18-T-7156.并電泳回收目的片段，之后用T4連接酶和回收的目的片段構(gòu)建連接體系，溫箱內(nèi)16℃培育24 h，同時制備BL21(DE3)感受態(tài)細胞，并轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，用含有kana抗性的固體平板培養(yǎng)基篩選，挑陽性單菌落搖菌，并進行菌落PCR和雙酶切質(zhì)粒檢測，送檢測序，正確后命名為pET30a-7155和pET30a-7156，此為重組表達載體構(gòu)建成功，用作后續(xù)蛋白表達.

1.4 目的蛋白的誘導(dǎo)表達

將含有已測序正確的重組表達載體(pET30a-7155和pET30a-7156)BL21菌液接種于含有kana抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)3 h至OD值在0.4～0.6后加入終濃度為0.6 mmol/L的IPTG于28℃下?lián)u床培養(yǎng)8 h，誘導(dǎo)目的蛋白的表達，并用含有pET30a空載的BL21為對照.之后離心棄上清收集菌體，超聲波破碎取樣并加入β-巰基乙醇處理并于沸水中煮6 min，再加入5×Buffer，用SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達.

2 結(jié)果

2.1 all7155和asl7156的基因克隆

用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測T克隆酶切后的目的條帶，可見與預(yù)期大小(331 bp和258 bp)相符(見圖1).由于引物設(shè)計時有酶切位點和保護堿基，故檢測目的條帶的位置輕微上移，送檢測序pMD18-T-7155和pMD18-T-7156結(jié)果與NCBI公布的all7155和asl7156堿基序列100%吻合，證明成功克隆了目的基因.

M) Marker；1,2) 為未插入目的基因的PET30a(+)載體質(zhì)粒；3,4) 為插入asl7156的PMD18-T；5,6)為插入all7155的PMD18-T圖1 T克隆酶切后電泳檢測Fig.1 Electrophoresis identification of T clone after enzyme cutting

2.2 構(gòu)建重組表達載體

挑取陽性菌落搖菌后提取質(zhì)粒(見圖2),根據(jù)引物設(shè)計時插入的雙酶切位點BamH I/Hind III，對重組后的pET30a進行雙酶切，可見與目的片段大小相符的條帶(見圖3)，送檢同批菌液測序，測序結(jié)果與NCBI中的目的基因序列100%吻合，即驗證所插入片段為336 bp的all7155和258 bp的asl7156.

M) DNA Marker；1,2)為空載pET30a質(zhì)粒；3,4)插入all7155片段的重組表達載體質(zhì)粒；5,6)為插入片段為asl7156片段的重組表達載體質(zhì)粒圖2 電泳檢測重組表達載體的質(zhì)Fig.2 Electrophoresis identification of plasmid recombined with expression vector

M)Marker; 1,2)為插入all7155的PET30a ;3,4)為插入asl7156的pET30a圖3 重組表達載體Fig.3 Electrophoresis identification of recombinant expression vector

2.3 IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達

將含有目的基因all7155和asl7156的重組表達載體BL21菌液在0.6 mmol/L的IPTG，28℃搖床中培養(yǎng)，并設(shè)置時間梯度2,4,6,8 h誘導(dǎo)表達，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(見圖4)可見:分別在15KD上方和20KD下方由時間不同出現(xiàn)一條亮度逐漸增強的條帶，因預(yù)測all7155和asl7156基因的表達蛋白的分子量分別為13.2 KD和10.2 KD，又因pET30a (+) 表達載體的帶有6組氨酸標(biāo)簽，使產(chǎn)生的融合蛋白的分子量增加約5KD[7]，故目的條帶的位置應(yīng)該在15KD和20KD之間

30a IPTG) 加入了IPTG誘導(dǎo)的30a空載; 30a) 未加入IPTG的30a空載; M) Protein ladder圖4 SDS-PAGE 檢測不同時間下IPTG誘導(dǎo)表達all7155(圖A)和asl7156(圖B)Fig.4 SDS-PAGE identification of IPTG induced all7155(Fig.A) and asl7156 (Fig.B)expression at different hour

3 討論

本文先通過NCBI中BLAST序列分析發(fā)現(xiàn)PCC7120α質(zhì)粒上的基因all7155與大腸桿菌染色體上毒素基因ParE具有較高的同源性，而ParE在T-A系統(tǒng)中充當(dāng)一個毒素因子，它在細胞的DNA復(fù)制進程中通過促使DNA雙鏈解螺旋而起到毒素作用[5]，且與細胞的穩(wěn)定性生長密切相關(guān).asl7156通過BLAST蛋白比對后發(fā)現(xiàn)其與細胞生長中誘導(dǎo)沉溺模式產(chǎn)生的基因高度同源，推測其編碼蛋白起解毒作用.為此對基因構(gòu)成毒素-抗毒素系統(tǒng)提供了理論基礎(chǔ)，由于對ParD/E家族的性質(zhì)和作用研究認識較MazE/F家族少而不全，以此對基因來進一步研究ParD/E毒素抗毒素性質(zhì)具有較高的參考價值.

本文先設(shè)計帶有特殊雙酶切位點和保護堿基的引物，PCR克隆all7155和asl7156目的基因并純化后連接至pMD18-T載體，陽性克隆單菌落測序后證明成功構(gòu)建了目的基因的克隆載體，并通過DH5α感受態(tài)轉(zhuǎn)化連接目的基因片段至pET-30a，篩選陽性單菌落測序后構(gòu)建了序列正確的表達載體pET30a-7155和pET30a-7156.以BamH I/Hind III為酶切位點，主要考慮了其切割率和易連性，利用藍白斑篩選和DH5α感受態(tài)連接轉(zhuǎn)化的方法也符合技術(shù)成熟，可行可靠和重復(fù)性好的原則.

蛋白表達選擇了BL21的大腸桿菌作為表達菌，盡量減低了其他不利因素的影響，通過固定一個變量，梯度設(shè)計另一變量來進行比較，在相對的低溫，低轉(zhuǎn)速內(nèi)能提高表達量[9]，IPTG在誘導(dǎo)表達的同時因濃度而抑制菌體生長實驗確定了平衡蛋白表達和適合菌體生長的IPTG濃度.超聲波破碎的結(jié)果顯示：兩基因表達蛋白大量存在于菌體裂解液上清中，沉淀中微量存在是由于培養(yǎng)過程中形成的包涵體，說明此類蛋白應(yīng)為可溶性蛋白.設(shè)置時間梯度更易檢測到目的蛋白在合適的IPTG濃度(0.4～0.6 mmol/L)下，隨著不同培養(yǎng)時間表達量由少變多，并用于驗證目的蛋白的表達的大小和位置.

由于選用的表達載體質(zhì)粒pET-30a(+)帶有His-tag，在菌體大量培養(yǎng)后，可利用Ni柱進行純化，獲得純化后蛋白可研究其物理化學(xué)性質(zhì)及相互作用，用于其毒素抗毒素性質(zhì)的檢測及定性.鑒于毒素-抗毒素系統(tǒng)的研究在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的在興起，如某一對毒素-抗毒素基因?qū)υ诩毦L過程對其細胞進程起關(guān)鍵作用，故本研究還具有一定的理論意義和醫(yī)療實用價值.

參 考 文 獻

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