陳文榮， 陳雅彬， 陳 莉， 張常晶， 黃志恒， 孫培蓓

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

鋅是生物體不可缺少的微量元素之一[1]，在核酸合成、基因表達(dá)、細(xì)胞生長(zhǎng)等過程中起著至關(guān)重要的作用.植物中缺鋅會(huì)阻礙植株的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致產(chǎn)量和品種質(zhì)量下降.水稻(OryzasativaL.)作為重要的栽培糧食作物，對(duì)鋅元素極為敏感，一旦缺鋅，會(huì)引起水稻葉片失綠發(fā)白、根系老化、分蘗減少、植株矮小、生長(zhǎng)停滯等現(xiàn)象，從而嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量和口感[2].

缺鋅會(huì)直接或間接地影響SOD及AsA-GSH循環(huán)中相關(guān)酶的活性，從而限制對(duì)活性氧的清除.缺鋅條件下，不同物種的植物均表現(xiàn)出活性氧簇(ROS)的積聚及氧化脅迫的加劇，但抗氧化系統(tǒng)在不同物種間的表現(xiàn)不盡相同.水稻受缺鋅脅迫后，葉內(nèi)ROS含量上升、膜脂過氧化加劇,葉綠體超微結(jié)構(gòu)受損明顯，同時(shí)光合速率及熒光參數(shù)均顯示缺鋅對(duì)水稻光系統(tǒng)破壞嚴(yán)重[3],但這種損傷是否與ROS的氧化脅迫相關(guān)仍缺乏直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù).另外，作為產(chǎn)生ROS的主要細(xì)胞器，水稻葉綠體中ROS的濃度、抗氧化系統(tǒng)的抗氧化能力在缺鋅脅迫下的動(dòng)態(tài)變化亦需要進(jìn)一步深入研究.

本文以水稻品種日本晴(Nipponbare)為材料，利用水培法進(jìn)行不同程度的缺鋅處理，研究了水稻葉綠體中活性氧代謝水平、膜脂過氧化程度及抗氧化物質(zhì)(AsA和GSH)含量、SOD和AsA-GSH循環(huán)中相關(guān)酶(APX，GR等)活性在缺鋅脅迫中的動(dòng)態(tài)變化，以期揭示缺鋅脅迫下水稻葉綠體中抗氧化系統(tǒng)在防御氧化損傷中的響應(yīng)機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1.1 植物培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)材料為水稻品種日本晴.種子經(jīng)75%乙醇溶液消毒后，浸種2 d，37 ℃下催芽，挑選出芽較好且一致的種子移栽在96孔板上，放入溫室內(nèi)(光照14 h/黑暗10 h，白天28 ℃ /夜晚24 ℃，相對(duì)濕度75%，光照強(qiáng)度2 000 lx)用蒸餾水培養(yǎng)，2周后水稻用營養(yǎng)液培養(yǎng)[13]，營養(yǎng)液pH 5.5.

1.1.2 缺鋅處理

待水稻長(zhǎng)至三葉期進(jìn)行缺鋅處理.設(shè)計(jì)3個(gè)鋅處理組，即足鋅、潛在缺鋅及嚴(yán)重缺鋅，其鋅濃度分別設(shè)置為1.0×10-6,1.0×10-10和0 mol/L.鋅處理時(shí)間為20 d.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葉綠體的制備

待水稻處理完后，取地上部，通過差速離心法制備粗葉綠體制品，分別利用蔗糖密度梯度離心法和Percoll梯度離心法進(jìn)一步分離純化完整的葉綠體.緩沖溶液(0.05 mol/L磷酸鹽，5 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 7.8)懸浮葉綠體，用于測(cè)定抗壞血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)的含量，以及超氧化物歧化酶(SOD，EC 1.15.1.1)、抗壞血酸過氧化物酶(APX，EC 1.11.1.11)、谷胱甘肽還原酶(GR，EC 1.6.4.2)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR，EC 1.8.5.1)和單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR，EC 1.6.5.4)的活性.

1.2.2 水稻根和葉中鋅含量的測(cè)定

水稻處理好后，取根和葉，于65 ℃烘干研磨后，取0.1 g加8 mL硝酸和1 mL高氯酸，常溫靜置過夜，然后消解.樣品消解后用超純水定容至50 mL，過濾后用電感耦合等離子質(zhì)譜儀ICP-MS(Agilent，7500a)測(cè)定Zn元素的含量[14].

1.2.4 丙二醛(MDA)含量的測(cè)定

用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測(cè)定MDA含量.50 mg葉綠體樣品用80%乙醇溶液溶解，超聲波裂解，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，沉淀重新提取2次.稀釋一定倍數(shù)，加入等體積的100 g/L三氯乙酸(TCA)溶液，4 000 r/min離心10 min，上清液為樣品提取液[15].取提取液2 mL(空白加入等量的重蒸餾水)，加入2 mL 5 g/L TBA溶液混勻，沸水浴20 min，迅速冷卻離心10 min，測(cè)定A532 nm和A600 nm的值.

1.2.5 AsA和GSH含量的測(cè)定

取葉綠體懸浮液1 mL，加入1.5 mL重蒸餾水，2.5 mL 50 g/L TCA溶液，混勻，4 000 r/min離心，上清液用于測(cè)定AsA和GSH的含量.

取0.1 mL上清液，加0.7 mL 75 mmol/L NaH2PO4溶液(pH 7.4)，再加0.2 mL 100 g/L TCA溶液，0.2 mL 440 g/L H3PO4溶液，0.2 mL 40 g/L 2,2-二聯(lián)吡啶溶液和0.1 mL 30 g/L FeCl3溶液，37 ℃反應(yīng)1 h，測(cè)定A525 nm的值，根據(jù)AsA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算AsA的含量[16].

取0.1 mL上清液，加1.3 mL 150 mmol/L NaH2PO4溶液(pH 7.2)和0.1 mL 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，30 ℃保溫5 min，測(cè)定A412 nm的值.根據(jù)GSH的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算GSH的含量[17].

1.2.6 SOD活性的測(cè)定

SOD活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法測(cè)定.取0.05 mL酶液，加3 mL反應(yīng)液(1.3 μmol/L 核黃素,13 mmol/L甲硫銨酸,63 μmol/L NBT,100 μmol/L EDTA和0.5 mol/L pH 7.8磷酸鹽)混勻后，于光強(qiáng)4 000 lx下反應(yīng)15 min，測(cè)A560 nm的值，以緩沖液代替酶液作空白，以抑制氮藍(lán)四唑光化還原的50%為1個(gè)酶活單位[18].

1.2.7 APX活性的測(cè)定

APX活性的測(cè)定參照文獻(xiàn)[19]的方法，取3 mL反應(yīng)液(0.5 mmol/L AsA，0.1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L H2O2，0.05 mol/L pH 7.0磷酸鹽)和0.1 mL酶液，將30%H2O2溶液稀釋500倍，加15 μL至3 mL反應(yīng)體系中啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定A290 nm的值，記錄1 min內(nèi)的變化.抗壞血酸的消光系數(shù)為2.8 mmol/(L-15cm-1)，以1 min氧化1 μmol抗壞血酸的酶量為1個(gè)酶活單位.

1.2.8 GR活性的測(cè)定

依照文獻(xiàn)[20]的方法并適當(dāng)修改，即反應(yīng)體系中依次加2.46 mL 1 mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSG)溶液，0.24 mL 2 mmol/L還原型輔酶Ⅱ(NADPH.溶于磷酸緩沖液，pH 7.6)和0.3 mL酶提取液，以重蒸餾水代替GSSG溶液作空白對(duì)照，測(cè)定A340 nm的值，記錄3 min內(nèi)的變化.NADPH的消光系數(shù)為6.2 mmol/(L-15cm-1)，以1 min催化還原1 nmol谷胱甘肽的酶量為1個(gè)酶活單位.

1.2.9 DHAR活性的測(cè)定

采用紫外分光光度法測(cè)定DHAR的活性.在反應(yīng)體系中依次加入2.1 mL 50 mmol/L EDTA溶液，0.3 mL 2 mmol/L脫氫抗壞血酸(DHA)溶液,0.3 mL 2 mmol/L GSH溶液和0.3 mL酶提取液，測(cè)定A265 nm的值，記錄3 min內(nèi)的變化(消光系數(shù)為14 mmol/(L-15cm-1))[21].

1.2.10 MDHAR活性的測(cè)定

采用紫外分光光度法測(cè)定MDHAR活性.反應(yīng)體系中依次加入2.49 mL 2 mmol/L AsA溶液(磷酸緩沖液，pH 7.0),0.06 mL 2 mmol/L APX溶液(磷酸緩沖液，pH 5.6),0.15 mL 2 mmol/L NDAPH溶液(磷酸緩沖液，pH 7.6)和0.3 mL酶提取液，測(cè)定A340 nm的值，記錄3 min內(nèi)的變化(消光系數(shù)為6.2 mmol/(L-15cm-1))[21].

1.3 數(shù)據(jù)分析

每一處理進(jìn)行3次生物性重復(fù)和3次實(shí)驗(yàn)性重復(fù).數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和顯著性分析分別用Excel和SPSS 17.0軟件，用SigmaPlot 10.0軟件作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 缺鋅脅迫下水稻不同部位的鋅含量

為檢測(cè)水稻根部和葉部鋅營養(yǎng)的實(shí)際狀態(tài)，分析了不同缺鋅處理下根和葉中的鋅含量.如圖1所示，隨缺鋅處理的加重，水稻根部及葉部的鋅含量顯著降低.根部，潛在缺鋅處理和嚴(yán)重缺鋅處理后的鋅含量分別只有對(duì)照的19/50和7/25.葉部，各處理下鋅含量分別是40.8，15.6和10.6 mg/kg.另外，在不同缺鋅處理下，根部的鋅含量均比葉內(nèi)高，但兩者的變化趨勢(shì)是一致的.

不同小寫字母表示根和葉各處理間在P<0.05水平上差異顯著圖1 不同缺鋅條件下水稻根和葉鋅含量的變化

2.2 缺鋅脅迫下水稻葉綠體內(nèi)H2O2和的相對(duì)含量

對(duì)照的含量設(shè)為100%.不同的英文小寫字母表示各處理間在P<0.05水平上差異顯著圖2 缺鋅對(duì)水稻葉綠體內(nèi)過氧化氫和超氧陰離子自由基相對(duì)含量的影響

2.3 缺鋅脅迫下水稻葉綠體內(nèi)的MDA含量

丙二醛(MDA)是植物器官膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，其含量高低能說明膜脂過氧化程度的大小[22].如圖3所示：相較于對(duì)照，潛在缺鋅條件下，水稻葉綠體內(nèi)MDA含量雖有所上升，但未呈現(xiàn)出顯著性差異；在嚴(yán)重缺鋅處理下，水稻葉綠體中MDA含量達(dá)3.64 nmol/mg，較對(duì)照增加了76.70%.

2.4 缺鋅脅迫下水稻葉綠體內(nèi)AsA和GSH的含量

抗壞血酸(AsA)幾乎存在于所有的組織中，一般是在需氧的光合細(xì)胞和果實(shí)中含量較高，是一種非酶類的自由基清除劑.如圖4所示，隨著缺鋅程度的增加，AsA含量先升高再降低，其中潛在缺鋅條件下葉綠體AsA含量較對(duì)照升高了19.9%，而嚴(yán)重缺鋅下葉綠體內(nèi)AsA含量較對(duì)照

圖3 缺鋅對(duì)水稻葉綠體內(nèi)MDA含量的影響

降低了21.0%.但脫氫抗壞血酸(DHA)與AsA的變化趨勢(shì)相反.潛在缺鋅處理下DHA含量顯著降低，較對(duì)照降低了34.5%；而嚴(yán)重缺鋅處理下DHA含量與對(duì)照無顯著性差異.

葉綠體中谷胱甘肽(GSH)含量隨缺鋅程度的增加而不斷下降.對(duì)照植株GSH含量分別比潛在缺鋅和嚴(yán)重缺鋅處理的多0.29倍和1倍.氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量在對(duì)照、潛在缺鋅和嚴(yán)重缺鋅條件下分別是0.34，0.35和0.49 μmol/mg.

AsA/DHA和GSH/GSSG是植物細(xì)胞中相互關(guān)聯(lián)的重要的氧化還原對(duì)，它們的含量比能反映細(xì)胞內(nèi)氧化還原的狀態(tài)[23].本研究中，AsA/DHA的含量比隨著缺鋅程度的增加而先增加后降低，但GSH/GSSG的含量比隨著缺鋅程度的增加不斷降低.

圖4 缺鋅對(duì)水稻葉綠體內(nèi)抗壞血酸和谷胱甘肽含量的影響

2.5 缺鋅脅迫下水稻葉綠體內(nèi)SOD的活性

從圖5可見，潛在缺鋅處理下葉綠體內(nèi)SOD活性較對(duì)照有所上升，而嚴(yán)重缺鋅下該酶活性急劇下降.對(duì)照、潛在缺鋅和嚴(yán)重缺鋅處理下葉綠體內(nèi)SOD活性分別為152.44,181.89和76.13 U/mg.相較于對(duì)照，潛在缺鋅處理下葉綠體內(nèi)SOD活性上升了19.32%，嚴(yán)重缺鋅處理的下降了50.06%.

圖5 缺鋅對(duì)水稻葉綠體內(nèi)SOD活性的影響

2.6 缺鋅脅迫下水稻葉綠體內(nèi)APX的活性

在AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中， 抗壞血酸過氧化物酶(APX)以AsA為電子供體催化H2O2的還原.圖6顯示的是在缺鋅脅迫下水稻葉綠體內(nèi)APX活性的變化，該酶活性的變化趨勢(shì)與SOD相似，在潛在缺鋅處理下APX活性最高，達(dá)374.09 U/mg，而嚴(yán)重缺鋅處理的較對(duì)照的APX活性下降了40.27%.

圖6 缺鋅對(duì)水稻葉綠體內(nèi)APX活性的影響

2.7 缺鋅脅迫下水稻葉綠體內(nèi)GR的活性

谷胱甘肽還原酶(GR)是一種黃素蛋白氧化還原酶[24]，當(dāng)植物受氧化脅迫時(shí)，活性氧能將GSH氧化成GSSG，GSSG又能在GR的催化下利用NADPH的電子將GSSG還原為GSH.如圖7所示：潛在缺鋅處理下葉綠體內(nèi)GR活性最高，達(dá)到110.67 U/mg，是對(duì)照的2倍多；而嚴(yán)重缺鋅處理下葉綠體內(nèi)GR活性與對(duì)照相比無顯著性差異.

圖7 缺鋅對(duì)水稻葉綠體內(nèi)GR活性的影響

2.8 缺鋅脅迫下水稻葉綠體內(nèi)MDHAR的活性

單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)是AsA-GSH循環(huán)中再生AsA的重要酶.隨著缺鋅程度的增加，MDHAR的活性先升高后顯著下降.對(duì)照的MDHAR活性是163.64 U/mg，潛在缺鋅處理的比其活性升高了40.18%，而嚴(yán)重缺鋅處理的MDHAR活性下降了83.71%(見圖8).

圖8 缺鋅對(duì)水稻葉綠體內(nèi)MDHAR活性的影響

3 討 論

鋅在水稻的生長(zhǎng)發(fā)育中至關(guān)重要，可增加植物體內(nèi)的葉綠素含量，催化葉綠素的光合作用，間接影響生長(zhǎng)素的合成，在維持細(xì)胞膜的完整性等方面起作用.目前普遍認(rèn)為，缺鋅對(duì)植物造成損傷的根本原因在于鋅缺乏使植物體內(nèi)的活性氧自由基過量積累，進(jìn)而破壞植物細(xì)胞的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和重要成分[9].在正常生長(zhǎng)條件下，植物體內(nèi)活性氧濃度不高，并能及時(shí)被植物自身的抗氧化系統(tǒng)清除，從而使活性氧的產(chǎn)生和清除一直處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，避免了植物的損傷[25].但是，一旦活性氧的量超過了植物正常所能承受的閾值后，就會(huì)打破細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡，從而引發(fā)氧化脅迫傷害.

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，是產(chǎn)生活性氧的主要細(xì)胞器.缺鋅能引起光合反應(yīng)電子傳遞過程中超氧自由基的產(chǎn)生[26]，過量積累的活性氧自由基將對(duì)葉綠體類囊體膜造成嚴(yán)重傷害[27]，進(jìn)而破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能.本研究中活性氧在潛在缺鋅處理下產(chǎn)生的量最多，說明植物受到了一定的氧化脅迫；嚴(yán)重缺鋅處理下可能是過度的膜脂氧化對(duì)植物細(xì)胞造成了不可逆的損傷和破壞，甚至使細(xì)胞死亡，因此活性氧含量低于對(duì)照.同樣，MDA檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，在嚴(yán)重缺鋅處理中其含量最高，說明水稻葉綠體膜脂過氧化程度高，損傷程度大.

AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)是植物體內(nèi)清除活性氧自由基的重要途徑，該循環(huán)實(shí)質(zhì)上由2個(gè)小循環(huán)構(gòu)成，即AsA與MDHA之間的循環(huán)和GSH與GSSG之間的循環(huán).其中，AsA和GSH是AsA-GSH循環(huán)中2種重要的非酶促抗氧化物質(zhì)，它們能直接與活性氧反應(yīng)使其還原，或作為相應(yīng)酶的底物在活性氧清除過程中扮演重要的角色，通常兩者相互偶聯(lián)起作用(見圖9).AsA被氧化時(shí)會(huì)形成

圖9 潛在缺鋅脅迫下水稻葉綠體AsA-GSH循環(huán)模式圖

MDHA，MDHA很不穩(wěn)定，又會(huì)進(jìn)一步氧化形成DHA，DHA在DHAR作用下又可以再生成AsA.GSH因其結(jié)構(gòu)上存在巰基，使其成為細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)有力的還原劑，而氧化態(tài)的GSSG在GR的作用下能夠形成還原態(tài)的GSH.本研究中，在潛在缺鋅條件下，AsA含量顯著上升，而DHA含量呈相反的趨勢(shì)，這可能是水稻應(yīng)對(duì)缺鋅脅迫引發(fā)的ROS積聚的一種應(yīng)對(duì)反應(yīng)(見圖4(a)和(b))；而GSH含量隨著缺鋅程度的加重呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，可能是由于細(xì)胞內(nèi)大量的GSH用于各種活性氧的解毒過程，從而導(dǎo)致GSSG的含量遞增(見圖4(c)和(d)).另外，AsA/DHA和GSH/GSSG的含量比能反映細(xì)胞內(nèi)氧化還原的狀態(tài)，與植物響應(yīng)逆境脅迫緊密相關(guān)，植物體內(nèi)較高的AsA/DHA和GSH/GSSG的含量比有利于提高AsA-GSH循環(huán)的效率，減輕不良條件造成的氧化脅迫[32].本研究中，AsA/DHA含量比呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(見圖4(e))，說明在潛在缺鋅處理時(shí)，葉綠體內(nèi)通過加快AsA的合成，使抗壞血酸庫中還原型抗壞血酸占優(yōu)勢(shì)，從而增強(qiáng)抗逆性.這與桑樹[33]中受缺鋅影響得到的結(jié)果類似：AsA隨鋅濃度的降低先增加后下降，AsA/DHA含量比也是潛在缺鋅狀態(tài)下達(dá)最高值.另外，本研究中發(fā)現(xiàn),潛在缺鋅和嚴(yán)重缺鋅處理下GSH/GSSG含量比都小于對(duì)照(見圖4(f))，表明GSH和GSSG小循環(huán)隨著缺鋅程度的增加運(yùn)作效率降低.但水稻在缺鎂脅迫下GSH含量和GSH/GSSG含量比均出現(xiàn)顯著上升的變化[34].可見，AsA-GSH循環(huán)的變化復(fù)雜，不同物種對(duì)不同脅迫的應(yīng)對(duì)機(jī)制不同.

作為葉綠體中能有效分解H2O2的重要酶之一，APX先與H2O2形成中間復(fù)合物，接著以AsA為底物氧化形成MDHA和H2O.本實(shí)驗(yàn)中，1.0×10-10mol/L鋅處理的水稻葉綠體中APX活性高于對(duì)照，而且高活性的APX與高含量的AsA的作用是一致的.說明潛在缺鋅處理使葉綠體中的AsA含量足以維持APX的活性，甚至可能與高濃度的活性氧共同刺激APX活性升高.APX活性的適應(yīng)性升高同樣出現(xiàn)在缺鋅處理下的紅球甘藍(lán)[35]中.但APX對(duì)環(huán)境的脅迫非常敏感，嚴(yán)重缺鋅處理導(dǎo)致APX活性急劇下降(見圖6).MDHA可以在MDHAR作用下重新生成AsA.MDHAR的活性隨著缺鋅程度的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)(見圖8).嚴(yán)重缺鋅處理下葉綠體內(nèi)MDHAR活性較對(duì)照下降了83.71%，該酶活性急劇下降導(dǎo)致將MDHA還原成AsA的反應(yīng)速率下降，使得MDHA氧化成DHA的反應(yīng)增加，這與AsA/DHA含量比變化的結(jié)果相符(見圖4(e)).但本研究中未能在水稻葉綠體中檢測(cè)到DHAR的活性，可能是葉綠體中GSH循環(huán)與AsA循環(huán)偶聯(lián)作用小，靠GSH協(xié)同DHAR還原DHA生成AsA成分少.

在植物體內(nèi)，GR能使谷胱甘肽庫保持在還原狀態(tài)，AsA-GSH循環(huán)中GSSG通過GR還原.本研究中，GR活性與APX活性的變化相似，嚴(yán)重缺鋅處理下葉綠體內(nèi)GR活性與對(duì)照相當(dāng)，而潛在缺鋅處理下葉綠體內(nèi)GR活性是對(duì)照的2倍多.GR活性高使得GSSG的還原速度加快，有利于抵御ROS的毒害.Frei等[31]對(duì)水稻受土壤缺鋅影響時(shí)的抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)3種基因型的水稻(RIL46，IR74和RIL76)GR活性都極顯著上升，表明GR作為GSH循環(huán)中的關(guān)鍵酶，在水稻應(yīng)對(duì)缺鋅脅迫中發(fā)揮著重要作用.

綜上所述，本研究結(jié)果表明，在潛在缺鋅脅迫下，水稻葉綠體內(nèi)的活性氧含量升高，使得SOD,APX,GR和MDHAR的活性增加，說明植株通過增加抗氧化酶的活性來緩解外界環(huán)境產(chǎn)生的刺激及建立自我保護(hù)機(jī)制；另外，植株通過調(diào)節(jié)AsA-GSH循環(huán)中抗氧化物質(zhì)的水平來適應(yīng)逆境環(huán)境.但是，隨著缺鋅程度的加深，抑制了很多酶的活性，降低了植株的自我保護(hù)能力，加劇了膜脂過氧化的程度，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡.

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