潘建偉， 姜 楠， 王 超， 嚴(yán) 旭

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

網(wǎng)格蛋白是一類進(jìn)化上高度保守的蛋白復(fù)合體，在動物和酵母細(xì)胞中已有深入的研究.在動物細(xì)胞中，網(wǎng)格蛋白復(fù)合體由3條重鏈(clathrin heavy chains,CHC)和3條輕鏈(clathrin light chains,CLC)組成，形成一個三腳架結(jié)構(gòu)，一般由36個或60個三腳架復(fù)合體進(jìn)一步形成一個由12個五邊形和若干個六邊形組成的網(wǎng)格狀籠形結(jié)構(gòu)(網(wǎng)格蛋白因此而得名)，其中CHC是構(gòu)成三腳架結(jié)構(gòu)的主要骨架，而CLC具有調(diào)控網(wǎng)格蛋白籠型結(jié)構(gòu)組裝和拆卸的功能[1-3].目前，已知網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞(clathrin-mediated endocytosis,CME)是動物細(xì)胞最重要的內(nèi)吞途徑之一.

已知擬南芥基因組含有2個CHC和3個CLC同源基因[3].文獻(xiàn)[4]已經(jīng)鑒定了擬南芥CLC2和CLC3的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)CLC2和CLC3功能缺失改變了質(zhì)膜定位的生長素極性輸出載體PIN(PIN-FORMED)的內(nèi)吞、胞內(nèi)運輸和信號傳導(dǎo)功能，從而引起多種植物發(fā)育表型，表明植物網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞在生長素極性運輸和信號傳導(dǎo)過程中具有重要的生物學(xué)功能.本研究主要分離鑒定了擬南芥網(wǎng)格蛋白重鏈T-DNA插入突變體chc1和chc2，觀察分析了chc單突變體的發(fā)育表型，為進(jìn)一步研究植物網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗材料與生長條件

本研究所用擬南芥(Arabidopsisthaliana)生態(tài)型為Col-0(Columbia-0)，網(wǎng)格蛋白重鏈突變體chc1-1(SALK_112213)[4],chc1-2(Cs25142/SALK_103252)[4],chc1-3(SALK_018351),chc1-4(SALK_001652)和chc2-1(SALK_028826)[4],chc2-2(SALK_042321)[4],chc2-3(CS850328/WISCDSLOX289)[4],chc2-4(SALK_059018C)均購自美國俄亥俄州立大學(xué)擬南芥生物資源中心(ABRC).

擬南芥種子經(jīng)表面消毒后，在4 ℃黑暗處理3 d，然后在含1.5%瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基(Sigma 公司)表面萌發(fā)，培養(yǎng)皿豎直放置.生長條件為：24 ℃ 16 h光照/22 ℃ 8 h黑暗，相對濕度為70%～80%，光照強度為80～100 μmol5m-25s-2.萌發(fā)5 d后觀察幼苗表型.

營養(yǎng)土121 ℃高壓滅菌40 min，將生長7 d左右的幼苗轉(zhuǎn)移至土皿中，保鮮膜將幼苗蓋住，放置生長室培養(yǎng)2～4 d后去除保鮮膜，培養(yǎng)2周后提取葉片DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析.

1.2 擬南芥DNA的提取

提取生長2周左右植株幼苗的DNA，具體步驟如下：1)剪取擬南芥幼嫩葉片放入1.5 mL離心管中，加入200 μL提取液；2)用磨棒研磨離心管中的葉子，使其變成懸浮液；3)將懸浮液放入65 ℃烘箱中溫浴25～30 min，期間溫和混勻2～3次；4)加入65 μL醋酸鉀溶液，溫和混勻，放入-20 ℃冰箱中冰浴5 min；5)加入300 μL氯仿，劇烈混勻，然后12 000 r/min離心8 min；6)將上清液(180 μL)轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中，加入180 μL異丙醇，溫和混勻，室溫下靜置10 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清；7)加入800 μL 70%乙醇溶液，充分混勻，室溫下靜置10 min；8)12 000 r/min離心5 min，棄上清，放入烘箱干燥；9)干燥完成后加入150～200 μL PCR純凈水，然后將其-20 ℃儲存.

1.3 純合體的分離與鑒定

根據(jù)擬南芥突變體庫(ABRC)提供的T-DNA插入位點，設(shè)計了插入載體的引物SALK_LBb1,WisDs-p745和CHC基因上的F端和R端引物(見表1).以野生型(對照)或突變體基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增.

表1 引物序列信息

本實驗采用的PCR試劑盒為2×TaqMaster Mix(南京博爾迪生物科技有限公司).反應(yīng)體系為10 μL，包括5.1 μL 2×TaqMaster Mix，F(xiàn)端和R端引物各0.2 μL和1 μL DNA模板.PCR擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min.

1.4 突變體表型的分析

對野生型、重鏈突變體chc1和chc2的幼苗子葉表型進(jìn)行統(tǒng)計分析，照片由OLYmpus體式解剖顯微鏡獲得.

1.5 人工雜交

為制備chc1chc2雙突變體，將chc1和chc2突變體進(jìn)行人工雜交，具體方法如下：1)以花瓣開勢良好(花完全展開，呈十字狀，雄蕊鮮黃色)的花作為父本，以剛露白(能看到白色花瓣但未展開)的花作為母本；2)用鑷子輕輕移去母本的花萼、花瓣和雄蕊(呈微黃色)，留下柱頭；3)取下父本的雄蕊，在母本花柱頭上輕輕擦拭數(shù)次，并做好標(biāo)記；4)1～2 d后，如果母本柱頭迅速發(fā)育成豆莢則表明雜交成功.

2 結(jié) 果

2.1 網(wǎng)格蛋白重鏈的生物學(xué)信息學(xué)分析

根據(jù)哺乳動物重鏈氨基酸序列，從擬南芥信息資源網(wǎng)站(TAIR.http://www.arabidopsis.org/)中檢索到2個重鏈基因(見圖1)，分別被命名為AtCHC1(AT3G11130)和AtCHC2(At3G08530).這兩個網(wǎng)格蛋白重鏈CHC間的氨基酸同源性高達(dá)98%，推測它們之間在遺傳上存在功能冗余.

在擬南芥信息資源網(wǎng)站突變體庫中，CHC1和CHC2基因中均找到4個T-DNA插入株系，具體插入位點如圖1所示.重鏈CHC1的4個突變體chc1-1,chc1-2,chc1-3和chc1-4中，T-DNA的插入位點分別位于第9,24,25和25個外顯子上(見圖1(a)).在重鏈CHC2的突變體中，chc2-2和chc2-3的T-DNA插入位點分別位于第25和第5個外顯子上，而chc2-1和chc2-4的T-DNA分別插入在第1個內(nèi)含子和3′-UTR上(見圖1(b)).每個CHC基因上都設(shè)計3對引物組合:F1+R1,F2+R2和F3+R3(見圖1),對相應(yīng)突變株系進(jìn)行PCR篩選.

白色和黑色分別代表非編碼區(qū)和外顯子；實線代表內(nèi)含子箭頭代表T-DNA插入位點；箭(F1,F2,F3,R1,R2和R3)代表PCR引物設(shè)計位置圖1 擬南芥CHC基因結(jié)構(gòu)示意圖及T-DNA插入位點

2.2 網(wǎng)格蛋白重鏈CHC基因T-DNA突變體的鑒定與分離

已知T-DNA標(biāo)簽法只產(chǎn)生35%～40%的突變率[5]，通過PCR擴(kuò)增篩選可獲得所需的純合T-DNA插入株系.當(dāng)用基因自身引物F+R未能擴(kuò)增出全長片段，表明突變體中該基因已經(jīng)被徹底敲除.圖2(a)為生物誘變T-DNA插入敲除目的基因的模式圖.通過T-DNA插入敲除的方法，可以獲得如圖2(b)所示的3種基因型：1)野生型(WT)，目的基因沒有插入T-DNA，其基因功能保持完整,F+R引物組合可擴(kuò)增出全長(大片段)(見圖2(c))，但不能和T-DNA上的引物擴(kuò)增出小片段；2)雜合型(Het)，目的基因的一條DNA鏈為野生型，另一條鏈被T-DNA插入，F(xiàn)+R引物組合既能擴(kuò)增出大片段，又能和T-DNA上的引物擴(kuò)增出小片段，電泳結(jié)果顯示產(chǎn)生大小不同的2條帶(見圖2(c))；3)純合型(Hom)，目的基因2條DNA鏈均被T-DNA插入，該基因被完全敲除,F+R組合無法擴(kuò)增出全長片段，只能和T-DNA上的引物擴(kuò)增出小片段(見圖2(c)).第3種純合基因型是本研究所期望的.

P1代表5′端引物；P2代表3′端引物；LBb1代表T-DNA插入引物；WT代表野生型；Het代表雜合型；Hom代表純合型箭(圖(c)中)分別代表了大片段(上)和小片段(下)圖2 擬南芥chc突變體PCR篩選

2.3 網(wǎng)格蛋白重鏈CHC突變體的表型分析

已知網(wǎng)格蛋白輕鏈CLC功能缺失后可導(dǎo)致多種發(fā)育表型缺陷[4]，如根變短、下胚軸變長、根的向地性反應(yīng)遲鈍，這些表型與生長素相關(guān)的表型缺陷相似[3,6-9].通過PCR分析，chc1和chc2均獲得了純合單突變體.發(fā)育表型分析表明，重鏈CHC功能缺失后也引起部分單突變體植株發(fā)育異常，表現(xiàn)出生長素相關(guān)的發(fā)育表型，如幼苗子葉出現(xiàn)棒狀、喇叭狀和扇形等各種異常表型(見圖3).

A：野生型子葉表型；B-D：單子葉表型(chc1)；E：棒狀子葉表型(chc2)；F和G：喇叭狀子葉表型(chc2)；H和J：扇形子葉表型(chc2)；I：異常雙子葉表型(chc2)；A-J均為10 d的幼苗;標(biāo)尺=2 mm圖3 擬南芥chc1和chc2突變體發(fā)育表型

為分析chc1和chc2各等位突變體的表型缺陷程度，本研究進(jìn)一步統(tǒng)計分析了各突變體幼苗發(fā)育缺陷的百分比.統(tǒng)計分析結(jié)果表明，chc2植株發(fā)育異常比例明顯高于chc1突變體(見表2).在正常條件下培養(yǎng)，chc1-1,chc1-2(見圖3中B)，chc1-3(見圖3中C)和chc1-4(見圖3中D)單突變體有發(fā)育缺陷的植株分別占0.6%，1.3%，0.6%和0.9%(見表2)，主要表現(xiàn)為單子葉表型.而chc2單突變體中除chc2-4僅有0.7%的異常表型外，其余單突變體chc2-1(見圖3中E和F)，chc2-2(見圖3中H和I)和chc2-3的植株發(fā)育異常比例高達(dá)4.3%，8.0%和4.7%(見表2)，并且幼苗子葉出現(xiàn)棒形(見圖3中E)、喇叭形(見圖3中F和G)、扇形(見圖3中H和J)、單子葉和異形雙子葉(見圖3中I)表型.這些結(jié)果表明，CHC1和CHC2的遺傳功能存在冗余，但從表型上看似乎CHC2具有更重要的發(fā)育功能.

表2 擬南芥chc1和chc2突變體表型統(tǒng)計分析

為進(jìn)一步揭示CHC的生物學(xué)功能，將chc1和chc2兩個單突變體進(jìn)行人工雜交.但很遺憾的是，對雜交F2分離群體進(jìn)行大量的分析鑒定，均未能獲得chc1chc2純合雙突變體，表明CHC1和CHC2功能同時缺失可能引起花粉致死或胚胎致死.這進(jìn)一步表明CHC1和CHC2在遺傳學(xué)上具有功能冗余，對植物生長發(fā)育不可或缺.

3 討 論

最近的研究表明，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞也參與調(diào)控植物的生長發(fā)育和環(huán)境響應(yīng)[4,10-14].clc2clc3雙突變體具有短根長胚軸表型，其根尖向地性、側(cè)根啟動、根毛極性分布及對外源生長素的敏感性均受到明顯抑制，植株未能直立，葉和豆莢的發(fā)育、表皮毛的形成也受到很大的影響[4].而在chc單突變體中，具有突變表型的個體一般很難在土壤中成活(見圖3)，并且未能獲得chc1chc2雙突變體，表明在植物發(fā)育過程中，CHC比CLC具有更重要的生物學(xué)功能.功能缺失的重鏈chc2單突變體和CHC1(HUB)負(fù)顯性突變體的質(zhì)膜蛋白內(nèi)吞也受到顯著性抑制[10].另外，最近的遺傳學(xué)證據(jù)表明，擬南芥接頭蛋白AP2 (adaptor protein 2)A1或μ2或σ亞基功能缺失也抑制質(zhì)膜蛋白內(nèi)吞，導(dǎo)致維管束發(fā)育異常，營養(yǎng)生長減弱，豆莢發(fā)育缺陷及繁殖能力下降[12-14].而最近發(fā)現(xiàn)一類植物特有的接頭蛋白復(fù)合體TPLATE(adaptin-like protein with a role in cell plate anchorage)[11]，該復(fù)合體部分功能缺失嚴(yán)重?fù)p害由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的質(zhì)膜蛋白內(nèi)吞，表明該復(fù)合體是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞所必需的.

本研究實驗結(jié)果與文獻(xiàn)[10]的報道相一致：CHC2功能缺失導(dǎo)致植物發(fā)育缺陷，幼苗子葉出現(xiàn)棒狀、喇叭狀、扇形、單子葉和異常雙子葉等表型，這些很可能與生長素極性運輸、分布的改變相關(guān)，這些與pin,tmk和ap2σ及生長素運輸抑制劑處理過的植物表型[12-16]類似.但文獻(xiàn)[10]的研究表明chc1-1和chc1-2單突變體表型正常，未發(fā)現(xiàn)異常發(fā)育，而本研究發(fā)現(xiàn)chc1-1，chc1-2，chc1-3和chc1-4單突變體均出現(xiàn)少量單子葉表型；同時，文獻(xiàn)[10]的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明chc2-1和chc2-2單突變體中分別約有14%和21%的異常子葉表型，該比例遠(yuǎn)高于本研究的實驗結(jié)果.這些差異很可能起因于突變體的培養(yǎng)條件或生長環(huán)境不同，也可能是因為統(tǒng)計方法不同而造成的.

已知外源生長素能夠抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑[4,17].在根表皮細(xì)胞中，生長素通過ABP1(AUXIN BINDING PROTEIN 1)負(fù)調(diào)控PIN1和PIN2的內(nèi)吞[17-18].根據(jù)clc1clc2雙突變體和abp1突變體具有相似的表型，推測CLC和ABP1在調(diào)控質(zhì)膜定位的膜蛋白內(nèi)吞時很可能位于同一通路中[4].但CHC和ABP1之間是否存在相互作用，目前還沒有明確的證據(jù).因此，本研究觀察分析了chc單突變體的發(fā)育表型，為進(jìn)一步研究植物網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞的調(diào)控機(jī)制提供了新的材料.

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