姜 楠，楊永革，宋麗雪，許雪廷 (北京軍區(qū)總醫(yī)院藥理科，北京 100700)

非布司他 (febuxostat，F(xiàn)EB) 是新型的非嘌類黃嘌呤氧化酶選擇性抑制劑[1]，臨床上用于預(yù)防和治療高尿酸血癥及引發(fā)的痛風(fēng)。其化學(xué)名稱為(3-氰基-4-異丁氧基苯基) -4-甲基 -5-唑甲酸，是美國 FDA于 2009 年 2 月 13 日批準(zhǔn)的用于治療尿酸過高癥的藥物，至今國內(nèi)仍未上市。到目前為止，關(guān)于非布司他的研究報(bào)道較少。為了更清楚了解非布司他的藥學(xué)特點(diǎn)，本研究建立了簡單、靈敏的LC-MS-MS檢測人血漿非布司他濃度的方法，適用于非布司他人體藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性研究。

1 儀器與試劑

1.1儀器 質(zhì)譜儀：Thermo Finnigan TSQ Quantum型液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子化源(ESI源)；Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)： G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器；G1312A二元梯度泵；在線脫氣機(jī)、柱溫箱(美國Agilent公司)、分析柱為Thermo Biobasic-8柱(5 μm,50 mm×2.1 mm)；FinniganXcalibur 色譜/質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)。Sigma1-14型高速離心機(jī)(美國Sigma公司)；XW-80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器有限公司)；Ohaus Discovery型電子分析天平(奧豪斯國際貿(mào)易有限公司)。

1.2試劑 非布司他對(duì)照品(南京海辰藥業(yè)有限公司，純度99.5%，批號(hào)：20100401)，內(nèi)標(biāo)苯扎貝特對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100732-200501)。乙腈、甲醇為色譜純(均為Merck公司)；乙酸胺、甲酸為分析純，水為重蒸去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1試驗(yàn)條件

2.1.1色譜條件 色譜柱：Thermo Biobasic-8柱(5 μm,50 mm×2.1 mm),流動(dòng)相：乙腈-10 mmol/L乙酸銨(含0.05%甲酸)(70:30)，流速：0.2 ml/min；柱溫：室溫。

2.1.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子化電離源ESI負(fù)離子檢測，噴霧電壓(SP)3 500 kV，鞘氣(SGP)流速10 Arb，輔助氣(AGP)流速45 Arb，毛細(xì)管溫度(TEM 270 ℃；非布司他和內(nèi)標(biāo)苯扎貝特的碰撞能量分別為10、18 eV；選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)分別測定非布司他和內(nèi)標(biāo)苯扎貝特負(fù)離子m/z315→271和m/z360→274；掃描時(shí)間為0.5 s。

2.2血漿樣本的預(yù)處理 精密量取血漿樣品100 μl，置1.5 ml具塞小塑料管中，加10 μl內(nèi)標(biāo)溶液(苯扎貝特，50 μg/ml)混勻，再加300 μl 乙腈→在微型混合器上渦流振蕩2 min(沉淀蛋白)→離心(10 000 r/min)10 min分層，取上清夜100 μl放入進(jìn)樣瓶中，10 μl進(jìn)樣檢測。

2.3方法的專屬性 按選定的LC-MS-MS條件測試6名健康人的空白血漿、空白血漿+非布司他標(biāo)準(zhǔn)樣品+內(nèi)標(biāo)、受試者口服非布司他片后的血漿樣品，來對(duì)特異性進(jìn)行考察。由圖1可見非布司他與苯扎貝特分別在1.14和1.00 min出峰(圖中從左至右分別為總離子流圖、非布司他、苯扎貝特)，非布司他與苯扎貝特峰形良好，無雜質(zhì)峰干擾測定，專屬性好。

圖1 血漿中非布司他選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)色譜圖

2.4線性范圍和定量限 精稱10.05 mg非布司他對(duì)照品(相當(dāng)于非布司他10 mg)、10 mg苯扎貝特標(biāo)準(zhǔn)品，分別溶于10 ml甲醇成1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分裝后-70 ℃儲(chǔ)存待用。用1 g/L非布司他標(biāo)準(zhǔn)品溶液配成一系列濃度的工作溶液，分別取各濃度工作溶液10μl于90μl空白血漿中，使非布司他的血漿終濃度分別為10、30、100、300、1 000、3 000、6 000、8 000 μg/L，余同血漿樣品處理和測定。將不同濃度系列標(biāo)準(zhǔn)樣品測得的非布司他與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，非布司他濃度為橫坐標(biāo)，直線加權(quán)回歸。得到線性回歸方程Y=0.003 094+0.000 756X，r>0.99。方法的最低檢測濃度為10 μg/L。

2.5精密度與回收率 按非布司他標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法制備質(zhì)控樣品，對(duì)30、1 000、7 000 μg/L 3種濃度進(jìn)行了連續(xù)3 d的6個(gè)樣本分析，以評(píng)價(jià)方法的日內(nèi)、日間精密度。以空白血漿乙腈沉淀提取液，加入非布司他與內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制低、中、高3種濃度(30、1 000、7 000 μg/L)的標(biāo)準(zhǔn)品樣本，計(jì)算回收率。以流動(dòng)相代替空白血漿，同樣方法配制低、中、高3種濃度(30、1 000、7 000 μg/L)的標(biāo)準(zhǔn)品樣本，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。方法學(xué)考察結(jié)果見表1。

表1 方法學(xué)考察結(jié)果

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 對(duì)室溫放置2 h、-70℃保存30 d、-70℃-室溫反復(fù)凍融3次的血漿樣品穩(wěn)定性進(jìn)行考察，低、中、高3個(gè)濃度變異均小于15%，符合指導(dǎo)原則要求；血漿樣本經(jīng)2.2項(xiàng)下預(yù)處理后室溫放置8 h可保持穩(wěn)定。

3 討論

非布司他是美國 FDA于 2009 年批準(zhǔn)的用于治療尿酸過高癥的藥物，至今國內(nèi)仍未上市。國內(nèi)發(fā)表的非布司他血藥濃度檢測的文獻(xiàn)較少[2，3]。為了更清楚地了解非布司他在中國人體內(nèi)的藥學(xué)特點(diǎn)，筆者建立了簡單、靈敏的LC-MS-MS檢測方法，并用于臨床生物樣本的大批量檢測。

本方法采用恒比流動(dòng)相質(zhì)譜檢測法，比熒光梯度檢測法[2]快捷靈敏；并通過優(yōu)化色譜條件，選擇了Thermo Biobasic-8柱(5 μm,50 mm×2.1 mm)，使單個(gè)樣品檢測僅需要2 min，比文獻(xiàn)[3]大大減少了檢測時(shí)間與環(huán)境污染；采用乙腈沉淀法，使血漿樣品處理非常簡便快捷。

本方法檢測專屬性強(qiáng)，靈敏度高，簡便快捷，適于臨床生物樣本的大批量檢測，對(duì)非布司他生物等效性與藥代動(dòng)力學(xué)研究有很好的參考價(jià)值。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Mayer MD, Khosravan R, Vernillet L,etal. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of febuxostal, a new non-purine selective inhibitor of xanthine oxidase, in subjects with renal impairment[J]. Am J Ther, 2005，12(1):22-34.

[2] 張文麗，程 航，陽國平.高效液相-熒光法測定人血漿中非布司他的濃度及其人體藥動(dòng)學(xué)研究[J].臨床藥理學(xué)，2011，16(10):1148-1152.

[3] 施 政，劉 健，申屠建中，等. 非布司他在中國健康人體的生物等效性[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2013，162(4)：276-279.