王嘉麟 劉雪梅 邢佳 王椿野 賀立娟 朱曉晨 郭蓉娟 李樂嘯 耿東 李麒豫 史華偉 劉旭 張允嶺

基于火毒病機研究急性腦梗死重癥大鼠皮層的核轉錄因子κB、c-fos蛋白表達及中藥干預效應

王嘉麟 劉雪梅 邢佳 王椿野 賀立娟 朱曉晨 郭蓉娟 李樂嘯 耿東 李麒豫 史華偉 劉旭 張允嶺

目的基于“火毒”病機觀察急性腦梗死重癥大鼠皮層的核轉錄因子κB(NF-κB)、c-fos蛋白表達及中藥干預效應。方法以Longa的方法略作改良制作鼠左側大腦中動脈阻塞再灌注模型，選擇Bederson評分>2分的重癥急性腦梗死大鼠，對照單純扶正方藥及單純解毒方藥，觀察扶正解毒方藥對急性腦梗死重癥大鼠的宏觀表征、NF-κB、c-fos蛋白表達的影響。結果(1)假手術組腦組織細胞核明顯呈淡淡的淺棕黃色，模型各組細胞核著色呈現(xiàn)明顯的棕黃色，以缺血24小時～48小時為主要變化，給予扶正藥、解毒藥和扶正解毒藥后，神經(jīng)核著色較淺，其中以扶正解毒藥改善效果較為明顯，各藥物組著色仍比假手術組明顯。腦組織細胞漿呈現(xiàn)相同趨勢；(2)缺血各模型組大鼠，缺血側c-fos和NF-κB蛋白表達明顯高于假手術組(P<0.01)，扶正藥和解毒藥治療組c-fos和NF-κB在缺血24小時～48小時時蛋白表達明顯低于模型組(P<0.05～0.01)，扶正解毒藥治療組在缺血各時間點c-fos和NF-κB的蛋白表達均明顯降低(P<0.01)。結論重癥急性腦梗死大鼠的NF-κB、c-fos蛋白明顯升高；扶正解毒中藥治療重癥腦梗死大鼠可能與調節(jié)NF-κB、c-fos蛋白表達水平有關。

腦梗死； 核轉錄因子κB蛋白； c-fos蛋白； 火毒

近年，“毒損腦絡”病機假說的提出[1]，極大地豐富發(fā)展了中風病的病因病機理論體系。毒邪依據(jù)其屬性，可分為火毒(熱毒)、寒毒、痰毒、瘀毒等。隨著生活方式、環(huán)境等變化，火毒致中風論逐漸成為研究熱點?；鸲玖魷X絡，閉阻腦竅，致使氣血逆亂，神明拂逆，發(fā)為中風[2]。中風病火毒論與現(xiàn)代醫(yī)學對腦梗死炎性細胞因子方面的研究相似。炎性因子參與免疫、應激、炎癥的調節(jié)，急性腦梗死病理機制[3]之一就是以核轉錄因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)為代表的炎癥介質的大量釋放，引起c-fos蛋白表達失調，進而導致神經(jīng)細胞凋亡。前期臨床工作中發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死重癥患者常有神志障礙、面紅目赤、口唇干裂、口臭、煩躁易怒、尿赤便秘、舌紅、脈數(shù)等火毒熾盛之象，也有倦怠乏力、少氣懶言等壯火食氣之征，提示其病機往往存在“火毒損絡傷正”?；诖?，本研究觀察急性腦梗死重癥大鼠皮層的NF-κB、c-fos蛋白表達及“扶正”、“解毒”、“扶正解毒”類中藥的干預效應，以期探索“火毒損絡傷正”病機的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組

健康雄性SPF級Sprague Dawley(SD)120只大鼠[批號：SCXK(京)2012-0001]，體重(180±20)g。按照隨機數(shù)字表法分為5組：假手術組、模型組、解毒組、扶正組、扶正解毒組，每組24只。各組再根據(jù)腦梗死時間隨機分為6小時、24小時、48小時、72小時四個亞組，每個亞組6只。

1.2動物模型建立

以Zea Longa的方法[4]略作改良制作鼠左側大腦中動脈阻塞模型，按Bederson評分方法判定模型成功，具體如下：

SD大鼠采用10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射進行麻醉，麻醉后仰臥固定于手術臺上，頸部正中切開，逐層分離組織，暴露左側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，永久結扎頸總動脈近心端、頸外動脈根部，微動脈夾暫時夾閉頸總動脈的遠心端，在頸總動脈結扎處遠心端剪一斜口，經(jīng)此斜口插入頂端光滑成球面的直徑0.24 mm的尼龍線，經(jīng)頸總動脈分叉處通過頸內動脈入顱至大腦前動脈的起始部，從而閉塞了大腦中動脈的起始部，造成了大腦中動脈供血相關區(qū)的梗死。尼龍線平均插入深度為(18.5±0.5)mm，結扎頸總動脈遠心端以固定尼龍線和防止出血，逐層縫合皮膚，尼龍線末端暴露在體外。假手術組除插線10 mm外，其余步驟同模型組。

觀察動物術后整體狀況并按Bederson等的方法對動物進行神經(jīng)癥狀體征評分。(1)提鼠尾離開地面約一尺觀察前肢屈曲情況，如雙前肢對稱伸向地面記為0分，如手術對側前肢出現(xiàn)肩屈曲肘屈曲肩內旋或既有腕肘的屈曲又有內旋者記為1分；(2)將動物置于平滑地面上分別推左右肩向對側移動檢查阻力，如對側阻力對等且有力記為0分，如向手術對側推動時阻力下降者記為1分；(3)將動物兩前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察兩前肢的肌張力，雙側肌張力對等且抓網(wǎng)有力者為0分、手術對側前肢肌張力下降記為1分；(4)提鼠尾離開地面一尺動物有不停的向手術對側旋轉者記為1分，否則記為0分；根據(jù)以上標準評分滿分為4分，分數(shù)越高動物的神經(jīng)癥狀越嚴重。

本研究選擇Bederson評分≥2分，即神經(jīng)癥狀較重者。

1.3給藥方法

解毒方藥：梔子10 g、板藍根10 g、金銀花10 g、黃芩10 g、丹參10 g。

扶正方藥：黨參15 g、黃芪10 g、白術10 g、丹參10 g。

扶正解毒方藥：黃芩10 g、梔子10 g、板藍根10 g、金銀花10 g、黨參15 g、黃芪10 g、白術10 g、丹參10 g。

分別將三方加水浸泡1小時，頭煎加水為總藥量的10倍，二煎加水為總藥量的4倍，取汁棄渣，合并二次藥汁，蒸發(fā)濃縮。均自北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院中藥房購買中藥飲片，自行煎制，以上煎劑質控由制劑室控制。中藥各組給予相應中藥湯劑灌胃，每天1次，連續(xù)給藥3天。模型組給藥時間和途徑同中藥組，以蒸餾水代替藥液。

劑量根據(jù)人與大鼠體表面積公式換算：dB=dA×(RB/RA)×(WA/WB)1/3。其中dB是欲求算的大鼠的公斤體重劑量，dA是已知人的公斤體重劑量，WA、WB是已知人和大鼠的體重，RB和RA是體型系數(shù)(RB=0.09，RA=0.1)

1.4觀察指標

1.4.1 宏觀表征觀察 以上各組大鼠均在實驗3天后進行以下宏觀表征觀察。包括：一般行為、飲水量、飲食量、大便情況、尿量、毛發(fā)色澤、情緒反應、活動度、體重、Bederson評分等宏觀表征變化。

1.4.2 梗死皮層NF-κB、c-fos蛋白測定 各組分別在實驗第6小時、第24小時、第48小時、第72小時，選擇6只大鼠進行測定。

各組大鼠梗死皮層NF-κB陽性細胞的測定[5]：免疫組織化學法，采用常規(guī)鏈霉親和素—生物素復合物(strept avidin-biotin complex,SABC)法。一抗(兔抗鼠多克隆NF-κB P65抗體)按1：100稀釋，4℃孵育過夜，隨機計數(shù)5個高倍鏡視野陽性細胞數(shù)。

各組大鼠梗死皮層c-fos蛋白測定[5]：免疫組織化學法，以過量的戊巴比妥(50～100 mg/kg)腹腔注射麻醉，開胸，左心室插管，灌注肝素鹽水50 ml (100 μ/ml)，迅速剪開右心耳并繼續(xù)灌注4%多聚甲醛磷酸緩沖液300 ml，30分鐘開顱取腦，去除小腦和腦干，以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片。采用卵白素—生物素—過氧化物酶復合物(ABC)法檢測c-fos蛋白，切片常規(guī)脫臘至水，滅活內源性酶，熱抗原修復滴加1∶100稀釋的兔抗c-fos抗體,4℃冰箱過夜，滴加生物素化羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)，滴加試劑SABC，二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色，蘇木素輕度復染。在高倍視野下(×400)，觀察缺血區(qū)，胞核有棕色顆粒者為陽性細胞，選取5個高倍視野計數(shù)陽性細胞的百分率。陽性細胞百分率=陽性細胞/(陽性細胞數(shù)+陰性細胞數(shù))100%

1.5統(tǒng)計學方法

將獲得的實驗數(shù)據(jù)輸入access數(shù)據(jù)庫，以均數(shù)±標準差來表示，采用SPSS 17.0軟件作統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩組間對比采用LSD檢驗，以P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異。

2 實驗結果

2.1一般情況觀察

造模前，各組大鼠體重、月齡及健康狀況無統(tǒng)計學差異。造模后，實驗動物在手術蘇醒后立即觀察，假手術組大鼠毛色光亮，精神狀態(tài)尚可，呼吸平穩(wěn)，反應敏捷，進食正常。模型組及中藥各組大鼠被毛蓬亂豎起，毛色黃暗，精神萎靡，進食量減少，身體消瘦，體重減輕，出現(xiàn)轉圈、不能直立，身體向右側偏轉或傾倒，出現(xiàn)偏癱癥狀，表現(xiàn)為側向擠壓時右側肢體肌力減弱，以前肢為重；提起大鼠尾部，右側前肢內收或內旋，后肢伸直，四肢伸出；行走時步態(tài)不穩(wěn)，向右側偏轉或傾倒；不能前行，出現(xiàn)原地向右側轉圈、追尾等運動，評分在3～4分。給藥3天后，觀察肢體偏癱癥狀，中藥各組均好于模型組，其中扶正解毒組好于扶正組、解毒組。

2.2免疫組化染色與圖像分析

免疫組化染色顯示，c-fos主要存在于細胞核內，假手術組腦組織細胞核明顯呈淡淡的淺棕黃色，模型各組細胞核著色呈現(xiàn)明顯的棕黃色，以缺血24～48小時為主要變化，給予扶正藥、解毒藥和扶正解毒藥后，神經(jīng)核著色較淺，其中以扶正解毒藥改善效果較為明顯，各藥物組著色仍比假手術組明顯。NF-κB多存在于胞漿中，假手術組腦組織細胞漿呈淡淡的淺棕黃色，模型各組著色呈現(xiàn)明顯的棕黃色，以缺血24～48小時為主要變化，給予扶正藥、解毒藥和扶正解毒藥后，細胞漿著色較淺，其中以扶正解毒藥改善效果較為明顯，各藥物組著色仍比假手術組明顯，見圖1、圖2。

圖像分析結果顯示，缺血各模型組大鼠，缺血側c-fos和NF-κB蛋白表達明顯高于假手術組(P<0.01)；扶正藥和解毒藥治療組c-fos和NF-κB在缺血24～48小時時蛋白表達明顯低于模型組，有顯著性差異(P<0.05～0.01)，扶正解毒藥治療組在缺血各時間點c-fos和NF-κB的蛋白表達均明顯降低(P<0.01)，見表1。

圖1 各組對急性腦梗死大鼠腦組織c-fos蛋白表達的變化(×200)

圖2 各組對急性腦梗死大鼠腦組織NF-κB蛋白表達的變化(×200)

表1 各組大鼠腦組織c-fos和NF-κB蛋白表達的差異比較

3 討論

急性腦梗死是嚴重威脅人類生命的三大主要死亡原因之一，有著很高的發(fā)病率、致殘率和致死率，其有效的治療還相當缺乏。急性腦梗死“毒損腦絡”病機假說是本時代的產(chǎn)物，“火毒”是其主要切入點。火毒與急性腦梗死發(fā)病機制的眾多病理產(chǎn)物關系密切，現(xiàn)代研究工作多圍繞各種炎癥因子展開，NF-κB具有一定代表性。許多研究表明，NF-κB參與了腦缺血再灌注損傷，調控細胞因子和炎性介質的轉錄，NF-κB活化增強了細胞因子等的轉錄，同時它們均可反過來激活NF-κB。c-fos為原癌基因，正常情況下，在神經(jīng)元中呈極低水平表達，但其作為細胞核的“第三信使”，通過啟動和調控某些具有特殊功能意義的靶基因的表達，對神經(jīng)元的生長、分化、再生和重塑起著舉足輕重的作用。研究發(fā)現(xiàn)，c-fos的表達與腦缺血缺氧后神經(jīng)元的信息傳遞、凋亡密切相關。腦缺血缺氧后即快速而短暫的誘導表達。c-fos的表達參與了腦缺血耐受，是腦缺血耐受的保護機制之一。c-fos蛋白的積累說明缺血后神經(jīng)元蛋白質合成能力的快速恢復[6-9]。也有學者認為c-fos參與腦缺血的損傷[10-11]。

本研究基于上述腦梗死“火毒損絡傷正”的病機，選用梔子、黃芩、板藍根、金銀花等清熱解毒類代表性中藥聯(lián)合黃芪、黨參、白術扶正益氣類中藥，以探索扶正解毒類中藥對重癥腦梗死大鼠炎性因子的影響。其中，梔子、黃芩、板藍根、金銀花是清開靈注射液的主要成分，該注射液集清熱解毒類藥物之大成，具有顯著的清熱解毒之功，用于中風病急性期，效果明顯。如張占軍等[12]提出清開靈可減輕腦缺血再灌注大鼠的內皮細胞損傷，阻止黏附因子的表達，減輕腦缺血后炎癥反應。嚴華等[13]指出黃芩苷、梔子苷可提高缺血損傷后神經(jīng)膠質細胞分泌神經(jīng)生長因子。同樣，扶正類中藥在腦梗死的病理機制中也起到積極作用。如黃芪注射液[14]對腦缺血性腦損傷大鼠有明顯的抗炎和減輕水腫作用，顯著降低腦缺血再灌注損傷后腦組織的含水量及基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)和白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的表達；白術多糖[15]能下調缺血區(qū)一氧化氮合酶的表達,減輕再灌注后腦水腫的程度；黨參總皂苷[16]對大鼠局灶性腦缺血性損傷有保護作用，與抑制炎癥相關基因的mRNA表達有關。

研究結果顯示，假手術組腦組織細胞核明顯呈淡淡的淺棕黃色，模型各組細胞核著色呈現(xiàn)明顯的棕黃色，以缺血24～48小時為主要變化，給予扶正藥、解毒藥和扶正解毒藥后，神經(jīng)核著色較淺，其中以扶正解毒藥改善效果較為明顯，各藥物組著色仍比假手術組明顯。NF-κB多存在于胞漿中，假手術組腦組織細胞漿呈淡淡的淺棕黃色，模型各組著色呈現(xiàn)明顯的棕黃色，以缺血24～48小時為主要變化，給予扶正藥、解毒藥和扶正解毒藥后，細胞漿著色較淺，其中以扶正解毒藥改善效果較為明顯，各藥物組著色仍比假手術組明顯，提示單純解毒、單純扶正均在一定程度上可減輕炎性因子NF-κB的表達，兩者聯(lián)合后這種作用可增強。

新時期,隨著人們生活水平及生活環(huán)境的變化,不良事件發(fā)生率逐漸增多,各大醫(yī)院、收治的急診內科患者數(shù)量也逐漸增多。權威數(shù)據(jù)顯示,我國每年收治的急診內科患者數(shù)量多達4000萬人次[1]。急診內科患者多呈現(xiàn)病情危急、發(fā)展迅速的特點,但患者及家屬由于對病情不了解或者其它因素,抵抗治療[2],導致病情惡化,威脅生命安全。因此,要對急診內科患者加以護理,保證患者康復效果。但不同的護理方案具有不同的效果,筆者為分析人性化護理價值,報道如下:

圖像分析結果顯示，缺血各模型組大鼠，缺血側c-fos和NF-κB蛋白表達明顯高于假手術組(P<0.01)；扶正藥和解毒藥治療組c-fos和NF-κB在缺血24小時～48小時時蛋白表達明顯低于模型組，有顯著性差異(P<0.05～0.01)，扶正解毒藥治療組在缺血各時間點c-fos和NF-κB的蛋白表達均明顯降低(P<0.01)，與部分文獻結果相似[17-18]，提示NF-κB與c-fos均參與腦缺血的損傷。

綜上，重癥急性腦梗死大鼠的NF-κB、c-fos蛋白明顯升高，以24～48小時最為顯著；扶正解毒中藥可能通過調節(jié)NF-κB、c-fos蛋白對重癥腦梗死大鼠起到防治作用。

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(本文編輯：蒲曉田)

ResearchontheexpressionofNF-κB,c-fosproteininrats’cortexwithacutecerebralinfarctionandinterventioneffectoftraditionalChinesemedicinebasedonpathogenesisoffiretoxin

WANGJia-lin,LIUXue-mei,XINGJia,etal.

DongFangHospitalAffilicatedtoBeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing100078,China

WANGJia-lin,E-mail:WJL2008420@sina.com

ObjectiveTo observe the expression of NF-κB and c-fos in rats’ cortex with acute cerebral infarction and intervention effects of traditional Chinese prescription based on fire toxin, a pathomechanism according to Chinese medicine.MethodsThe left middle cerebral artery occlusion rats’ models were established according to our slightly modified Longa’s method and severe acute cerebral infarction in rats with Bederson score >2 were selected, compared with simple Healthy-qi supporting prescription and simple toxin relieving prescription,to study the effect on the rats’ manifestations on macroscopic level and the expression of and c-fos in rats’ cortex with acute cerebral infarction using Healthy-qi supporting and toxin relieving prescription.Results(1)The brain nuclei in the sham operation group took on pale yellowish brown color obviously, and the nuclear stained in every model group showed brown yellow, significantly in ischemic 24h～48h, then they were treated with Healthy-qi supporting prescription, toxin relieving prescription and Healthy-qi supporting and toxin relieving prescription. The nerve nuclei were stained lighter, significantly improved in Fuzhegn Healthy-qi supporting Jiedu group, and every medicine group coloring still higher than the sham operation group. The cytoplasm in brain cells showed the same trend. (2)The expression of c-fos and NF-κB of the rats in every ischemic model group in the ischemic side was significantly higher than that in sham operation group (P<0.01); c-fos and NF-κB expression in Healthy-qi supporting group, toxin-relieving group was significantly lower than that in model group after ischemia for 24h～48h (P<0.05～0.01); the expression of c-fos and NF-κB in Healthy-qi supporting and toxin relieving group at each time point after ischemia were decreased significantly (P<0.01).ConclusionThe and c-fos in the rats with severe acute cerebral infarction increased significantly; Healthy-qi supporting and toxin relieving Chinese medicine may be related to the regulation of and c-fos expression in the treatment of severe cerebral infarction rats.

Cerebral infarction; Nuclear factor-kappa B protein; c-fos protein; Fire toxin

北京市科技計劃項目(Z111100056811040); 北京中醫(yī)藥大學創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃(2011-CXTD-23) ; 北京中醫(yī)藥大學自主選題項目(JYBZZ-JS042)

100078 北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院腦病二科[王嘉麟、邢佳、郭蓉娟、張允嶺、朱曉晨、賀立娟、耿東、王椿野( 博士研究生) 、李麒豫( 碩士研究生) 、史華偉( 博士研究生) 、李樂嘯( 博士研究生) 、劉旭( 碩士研究生) ]，實驗中心( 劉雪梅)

王嘉麟(1982-)，博士，主治醫(yī)師。研究方向: 中西醫(yī)結合防治腦病基礎與臨床研究。E-mail:WJL2008420@ sina.com

R277.7

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.01.002

2013-10-03)