楊悅 孔祥英 萬紅葉 蘇曉慧 林娜

地烏三萜皂苷W1對破骨細胞分化和骨吸收功能的影響

楊悅 孔祥英 萬紅葉 蘇曉慧 林娜

目的探討地烏三萜皂苷類成分W1對體外破骨細胞分化及骨吸收功能的影響。方法3個不同濃度(0.0625，0.125，0.25 μg/ml)的W1與核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor kB ligand，RANKL)誘導(dǎo)的小鼠單核/巨噬細胞RAW 264.7共孵育7天，抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色觀察TRAP陽性多核細胞的形成，甲苯胺藍染色及掃描電鏡觀察骨吸收陷窩的形成，圖像分析計算骨吸收陷窩面積百分比；同3個濃度的W1與RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細胞共孵育24小時后收集細胞上清液，放射免疫法檢測腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的含量；甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法檢測W1對RAW264.7細胞毒性影響。結(jié)果RANKL組誘導(dǎo)RAW 264.7細胞形成多量TRAP陽性多核細胞，形成明顯的骨吸收陷窩，并誘導(dǎo)TNF-α在RAW264.7細胞上清中異常高表達；與RANKL組相比，3個濃度的W1均能顯著減少TRAP陽性細胞數(shù)(P<0.01)，顯著減少骨吸收陷窩面積(P<0.01，P<0.001，P<0.001)，明顯降低TNF-α的表達量(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，且未觀察到對RAW264.7的細胞毒性。結(jié)論W1對由RANKL誘導(dǎo)的體外破骨細胞分化和骨吸收功能有一定的負調(diào)節(jié)作用。

地烏三萜皂苷W1; 小鼠單核/巨噬細胞RAW264.7; 腫瘤壞死因子α; 骨吸收

地烏總皂苷是民間治療風濕疼痛的單驗方地烏的主要活性成分群[1]，研究表明其具有抗炎免疫作用，且無明顯毒副反應(yīng)[2-3]。筆者在前期的地烏總皂苷活性成分篩選研究中發(fā)現(xiàn)，地烏三萜皂苷W1(以下簡稱W1)在地烏總皂苷中的含量接近最高，且具有較強的鎮(zhèn)痛抗炎活性及較好的骨免疫調(diào)節(jié)作用。為了有利于地烏治療類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)機制的闡明及地烏總皂苷的進一步研發(fā)，本研究擬通過核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor kB ligand，RANKL)誘導(dǎo)小鼠單核/巨噬細胞RAW 264.7細胞建立體外破骨細胞分化模型，觀察W1對破骨細胞分化、骨吸收功能及炎性因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)表達的影響,相關(guān)結(jié)果報道如下。

1 材料

1.1 細胞

小鼠單核/巨噬細胞系RAW 264.7(由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞庫提供)，加入含10%的胎牛血清、1%雙抗和谷氨酰胺的高糖(dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM)培養(yǎng)基，置于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細胞生長至80%～90%融合后進行傳代，2～3天傳代1次。

1.2 試劑

胎牛血清，高糖DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；小鼠重組可溶性核因子κB受體活化因子配體(soluble receptor activator of nuclear factor kB ligand，sRANKL)(英國Peprotech公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5二苯基四氮唑溴鹽(3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT)、甲苯胺藍、多聚賴氨酸、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色試劑盒(美國Sigma公司)；W1(廣州康和藥業(yè)有限公司提供)；牛骨片(北京榮志海達生物科技有限公司)；小鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)放射免疫試劑盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司)。

1.3 儀器

CO2培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司，HF151UV)；生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司，HFsafe-TE1200)；全自動酶標儀(Thermo公司，MK3型)。

2 方法

2.1 藥物制備

地烏三萜皂苷W1由廣州康和藥業(yè)有限公司提供。化學(xué)名稱為：3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-齊墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。純度為99.40%。

2.2 玻片與骨片的預(yù)處理

將直徑為8 mm的48孔板專用細胞爬片，充分清洗，高壓滅菌，超凈臺內(nèi)多聚賴氨酸包被。將由牛股骨皮質(zhì)部分制成的直徑6 mm的骨片，保存于4℃下70%乙醇中，實驗前先將骨片或包被過的細胞爬片置于培養(yǎng)板中，加入培養(yǎng)基沖洗3遍，孵育過夜，然后棄去舊液，接種細胞。

2.3 W1對破骨細胞生成的影響

將對數(shù)生長期RAW264.7細胞消化，制備單細胞懸液，以5×103個/孔的密度接種于預(yù)置有細胞爬片的48孔板中，每孔0.5 ml培養(yǎng)基，除空白對照組外，其它組均加入50 ng/ml RANKL誘導(dǎo)，給藥組同時加入W1使其濃度分別為0.0625、0.125、0.25 μg/ml，每組3個復(fù)孔。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，每2天換液1次，換液同時更換培養(yǎng)液中的誘導(dǎo)因子及藥物。誘導(dǎo)培養(yǎng)7天，用PBS沖洗細胞爬片3次，然后用4%多聚甲醛固定15分鐘，去離子水沖洗2遍，加入按照說明書配制的TRAP染液，37℃水浴孵育30分鐘，光鏡下觀察到含3個胞核以上且呈TRAP染色陽性的多核巨噬細胞為破骨細胞，計算陽性細胞平均值。

2.4 W1對骨吸收陷窩形成的影響

將對數(shù)生長期RAW264.7細胞消化，制備單細胞懸液，以2×103個/孔的密度接種于置有牛骨片的96孔板中，除正常對照組外，其它組均加入50 ng/ml RANKL誘導(dǎo)，給藥組同時加入W1使其濃度分別為0.0625、0.125、0.25 μg/ml，每組3復(fù)孔。隔天換1次液，各組細胞置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)7天。第7天取出骨片，用0.25 mol/L NH4OH溶液超聲洗滌10分鐘×3次，蒸餾水沖洗，梯度酒精(80%，90%，95%，100%I，100%II)脫水，每個梯度3分鐘。室溫1%甲苯胺藍染色8分鐘左右。蒸餾水沖洗，光鏡下觀察，用Image Pro Plus軟件分析整張骨片上骨陷窩的數(shù)量及面積百分比。將牛骨片超聲清洗干凈后，烘干、裝臺(粘膠)、表面真空離子噴金，掃描電子顯微鏡下觀察并攝像。

2.5 放射免疫法檢測W1對TNF-α表達的影響

將對數(shù)生長期RAW264.7細胞消化制備單細胞懸液，以1×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，待細胞長滿80%，加入含0.1%胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)的培養(yǎng)基，靜息24小時后，除正常對照組外，其它組均加入50 ng/ml RANKL誘導(dǎo)，給藥組同時加入W1使其濃度分別為0.0625、0.125、0.25 μg/ml，培養(yǎng)24小時，收集細胞上清液，按碘[I125]-腫瘤壞死因子放射免疫試劑盒說明步驟進行TNF-α含量測定，γ放免計數(shù)儀直接給出檢測數(shù)值。

2.6MTT法檢測W1對RAW264.7細胞毒性的影響

將對數(shù)生長期RAW264.7細胞消化，制備單細胞懸液，以1×104個/孔接種于96孔板，每孔200 μl，培養(yǎng)過夜。除正常對照組外，其它組均加入50 ng/ml RANKL誘導(dǎo)，給藥組同時加入W1使其濃度分別為0.0625、0.125、0.25 μg/ml。培養(yǎng)24小時后，每孔加入MTT(5 mg/ml) 10 μl，反應(yīng)4小時后，小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，震蕩10分鐘充分溶解，酶標儀在492 nm波長檢測吸光度值。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 W1對破骨細胞生成的影響

誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后進行TRAP染色，與空白對照組相比，RANKL組出現(xiàn)多個體積較大、胞漿呈玫紅色的多核細胞(核≥3個)(P<0.001)；與RANKL組相比，在不同濃度的W1作用下，破骨細胞數(shù)量均明顯降低(P<0.01)，說明W1具有明顯的抑制RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細胞形成破骨細胞的能力，見圖1及表1。

圖1 TRAP染色圖片(×400)

表1 W1對RAW264.7細胞誘導(dǎo)分化的TRAP陽性細胞數(shù)目的影響

注：與空白對照組比較，aP<0.001；與RANKL組比較，bP<0.01

3.2 W1對骨吸收陷窩形成的影響

藥物作用7天后，骨片經(jīng)甲苯胺藍染色，光鏡下可見藍紫色圓形、橢圓形或不規(guī)則形，大小不一，邊界清晰的吸收陷窩；掃描電鏡下觀察,骨吸收陷窩的變化趨勢與光鏡結(jié)果一致，同一標本可清楚識別形態(tài)相似的骨吸收陷窩。RANKL組可見較大面積的骨吸收陷窩形成；與RANKL組相比，0.0625、0.125、0.25 μg/ml的W1均可顯著抑制骨吸收陷窩形成，減少骨吸收陷窩面積(P<0.01，P<0.001，P<0.001)， 說明W1具有明顯的抑制RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細胞形成破骨細胞的能力，見圖2、圖3及表2。

圖2 骨吸收陷窩甲苯胺藍染色圖片(×200)

圖3 骨吸收陷窩掃描電鏡圖片(×200)

表2 W1對骨吸收陷窩形成面積的影響

注：與RANKL組比較，aP<0.01，bP<0.001

3.3W1對RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細胞TNF-α表達的影響

RANKL組TNF-α水平較空白對照組顯著升高(P<0.01)，說明RANKL誘導(dǎo)可顯著提高TNF-α在RAW264.7細胞中的分泌水平；0.0625、0.125、0.25 μg/ml的W1均可顯著降低由RANKL誘導(dǎo)的TNF-α在RAW264.7培養(yǎng)上清中的異常高表達(P<0.05，P<0.01和P<0.01)，說明W1可顯著抑制RAW264.7細胞分泌TNF-α，見表3。

表3 W1對RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細胞TNF-α表達的影響

注：與空白對照組比較，aP<0.01；與RANKL組比較，bP<0.05，cP<0.01

3.4 W1對RAW264.7細胞毒性的影響

MTT比色法所測各組吸光度值間接反映活細胞數(shù)量。結(jié)果顯示，在有/無RANKL誘導(dǎo)的情況下，W1在所觀察的濃度范圍內(nèi)，對RAW264.7均不具有明顯的增殖抑制作用，無細胞毒作用，見表4、表5。

表4 W1對RANKL誘導(dǎo)情況下細胞毒性的影響

表5 W1對無RANKL誘導(dǎo)情況下細胞毒性的影響

4 討論

破骨細胞在骨破壞中所起的關(guān)鍵作用已被研究所證實[4]。作為體內(nèi)唯一具有骨破壞能力的細胞，破骨細胞來源于單核/巨噬細胞系的造血前體細胞，并由這些前體細胞經(jīng)分化、融合而成終末多核巨細胞[5]。RAW264.7細胞是小鼠源性破骨前體細胞，目前，通過RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細胞獲得成熟破骨細胞是公認的體外研究破骨細胞分化的經(jīng)典體系[6-7]。該細胞體系不僅表達巨噬細胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor，M-CSF)， 還表達原癌基因c-fms(the proto-oncogene fms，c-fms)癌基因受體(c-fms receptor)和核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANK)，這也解釋了RAW264.7只需要RANKL誘導(dǎo)就能生成破骨細胞的原因[8-9]。本研究利用RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細胞向成熟破骨細胞分化方法，觀察到在RANKL誘導(dǎo)下，RAW264.7細胞由類圓形單核細胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榘w較大、邊緣不整齊、周圍有刷狀緣(褶皺)和偽足的多核細胞，且在誘導(dǎo)的第7天左右多核細胞數(shù)量達到高峰，經(jīng)TRAP染色可見多量胞漿成玫紅色的多核(核≥3個)TRAP陽性細胞，提示了本實驗條件下，破骨細胞在體外的誘導(dǎo)分化成功。當給予不同濃度的W1干預(yù)后，TRAP陽性細胞數(shù)目均顯著減少，提示了W1可抑制破骨細胞的分化。

破骨細胞形態(tài)和功能成熟是兩個相對獨立的階段，功能成熟的破骨細胞可黏附于骨的表面并遷移造成不規(guī)則、波狀的哈氏陷窩，形成骨侵蝕[10]，因此通過骨片上的陷窩面積反映破骨細胞的骨吸收活性，是目前定量評定體外培養(yǎng)破骨細胞活性的可靠方法之一[11]。本實驗發(fā)現(xiàn)RANKL誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，牛骨片經(jīng)甲苯胺藍染色，光鏡下可見圓形、橢圓形、串珠形、臘腸形或不規(guī)則形等呈藍紫色異染的陷窩，散在分布，邊界清晰，大小不一；掃描電鏡下觀察，骨吸收陷窩的變化趨勢與光鏡結(jié)果一致，同一標本可清楚識別形態(tài)相似的骨吸收陷窩，邊界輪廓清晰，陷窩底部粗糙，纖維紋路清晰可見，表明了本實驗條件下所誘導(dǎo)形成的破骨細胞具有骨吸收功能。當給予不同濃度的W1干預(yù)后，骨吸收陷窩面積和數(shù)量顯著減少，提示了W1可抑制破骨細胞的骨吸收功能。

TNF-α不僅能直接誘導(dǎo)破骨細胞分化并刺激其活性，還能通過影響OPG/RANKL/RANK信號系統(tǒng)，以旁分泌形式調(diào)節(jié)破骨細胞分化，刺激骨吸收[12]。本實驗發(fā)現(xiàn)，TNF-α經(jīng)RANKL誘導(dǎo)在RAW264.7細胞中異常高表達，而一定濃度的W1能顯著抑制TNF-α的表達水平，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，提示W(wǎng)1能有效降低關(guān)鍵炎癥因子的表達。地烏總皂苷對RA的抑制作用已被前期的實驗研究所證實，目前已知的相關(guān)作用機制是通過上調(diào)CIA小鼠外周血免疫負相調(diào)控受體細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)以及細胞因子白介素10(interleukin 10，IL-10)、白介素4(interleukin 4，IL-4)、干擾素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)的表達水平，抑制滑膜細胞增殖，減少血管翳形成，減少關(guān)節(jié)軟骨破壞，改善RA病情[13-15]。本研究通過體外實驗證明了地烏總皂苷最重要的活性成分之一W1能顯著抑制細胞因子TNF-α在體外培養(yǎng)的RAW264.7細胞中的分泌，同時有效負調(diào)節(jié)RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞分化和骨吸收，這可能是W1發(fā)揮免疫抗炎作用的藥效分子機制之一。相關(guān)研究結(jié)果將為地烏總皂苷治療RA機制的闡明提供初步的科學(xué)依據(jù)。

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(本文編輯：董歷華)

EffectoftriterpenesaponinW1fromrhizomeofAnemoneFlaccidonosteoclastsdifferentiationandboneresoroption

YANGYue,KONGXiang-ying,WANHong-ye,etal.

InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China

LINNa，E-mail:linna888@163.com

ObjectiveTo observe the effect of W1from rhizome of Anemone Flaccid on osteoclasts formation and bone resoroption in vitro.MethodsRAW264.7 cells induced by RANKL were cultured with three variable concentration(0.0625,0.125,0.25 μg·ml-1)of W1in vitro for 7 days. The influence of W1on osteoclasts differentiation was assessed by osteoclast-like number and tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) activity; resorption lacunae were stained by toluidine blue and were visualized by Philips XL30 scanning electron microscope. The number of TRAP+ cells and the percentage of resorption pits were counted. RAW264.7 cells induced by RANKL were incubated with three variable concentration of W1 in vitro for 24 hours, the level of TNF-α in cell culture supernatant was examined by Iodine[125I] Tunmor Necrosis Factor Radioimmunoassay kit; RAW264.7 cell viability was assayed by MTT.ResultsRANKL could induce RAW264.7 cells to form TRAP positive multinucleated cells and form bone resorption pits on bone. RANKL could induce abnormally high expression of TNF-α in RAW264.7 cells. W1(0.0625,0.125,0.25 μg· ml-1)could decrease the number of TRAP+ cells (P<0.01) as well as the area of bone resorption pits(P<0.01，P<0.001，P<0.001),and showed no cytotoxicity to RAW264.7; W1(0.0625-0.25 μg· ml-1)could suppresse the expression of TNF-a(P<0.05，P<0.01，P<0.01).ConclusionRANKL induced osteoclastogenesis in these monocytic cells,and W1inhibited RANKL-induced tumor necrosis factor-α production and osteoclast differentiation and bone resorption pit formation.

Triterpene saponin W1 from rhizome of Anemone Flaccid ； RAW264.7； Tumor necrosis factor-α； Bone resoroption

國家科技重大專項(2011ZX09101-006-03)；北京市自然科學(xué)基金(7112096)；中國中醫(yī)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費自主選題(ZZ070836)

100700 北京，中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所中藥理論與本草文獻研究中心

楊悅(1989- )，女， 2011級碩士研究生。研究方向：中藥藥理研究。E-mail: yangyue8675658@163.com

林娜(1963- )，女，博士，研究員，博士生導(dǎo)師。研究方向：中藥藥性理論與中藥藥理。E-mail:linna888@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.03.007

2013-12-03)