虞歡東++++++于海濤++++++夏建國++++++李軍++++++丁鴻飛++++++周紅建++++++裴靜波

[摘要] 目的 觀察順鉑（CDDP）聯(lián)合吡柔比星（THP）對(duì)腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株增殖的抑制作用。 方法 采用MTT法檢測不同濃度CDDP、THP以及兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)U87細(xì)胞增殖作用的影響。 結(jié)果 隨藥物濃度增加，CDDP組、THP組和聯(lián)合組對(duì)U87細(xì)胞增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)（均P<0.01）。聯(lián)合組對(duì)U87細(xì)胞增殖抑制率較同濃度CDDP組、THP組明顯增加（P<0.05或P<0.01）。當(dāng)CDDP和THP濃度為≤0.625μg/mL時(shí)，聯(lián)合組Q值分別為1.72、1.31，兩藥聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用，當(dāng)CDDP和THP濃度≥1.25μg/mL時(shí)，聯(lián)合組Q值分別為0.94、0.88、0.86、0.89，兩藥聯(lián)合應(yīng)用具有相加作用。 結(jié)論 CDDP聯(lián)合THP較單純的CDDP或THP抑制U87細(xì)胞增殖作用更強(qiáng)，具有濃度依賴性。在較低劑量下就能達(dá)到明顯腫瘤抑制效應(yīng)，對(duì)殺傷U87細(xì)胞具有確切協(xié)同效應(yīng)。

[關(guān)鍵詞] 腦膠質(zhì)瘤；MTT；順鉑；吡柔比星；增殖

[中圖分類號(hào)] R739.4[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1673-9701（2014）15-0001-03

Inhibition effect of cis-diaminedichloroplatinum(CDDP) combined with pirarubicin (THP) on cell proliferation of brain glioma U87

YU Huandong YU Haitao XIA Jianguo LI Jun DING Hongfei ZHOU Hongjian PEI Jingbo

Encephalopathy Center, Xiaoshan Traditional Chinese Medicine Hospital of Hangzhou, Hangzhou 311200, China

[Abstract] Objective To discuss inhibition effect of cis-Diaminedichloroplatinum (CDDP) combined with Pirarubicin (THP) on cell proliferation of brain glioma U87. Methods The MTT method was applied to detect the cell proliferation of brain glioma U87 in the influence by CDDP, THP and the combination of both under different concentration. ResultsAs the concentration of drugs rose, the influences on inhibition of cell proliferation of brain glioma U87 in CDDP group, THP group and combination group were enhanced gradually(P<0.01 on average). Compared with CDDP group and THP group under the same concentration, the inhibitory rate of cell proliferation obviously rose (P<0.05 or P<0.01). When the concentration in CDDP group and THP group was no more than 0.625μg/mL, the Q value in combination group were 1.72 and 1.31 respectively, which showed the coordination effect of combination of these two drugs. When the concentration in CDDP group and THP group was no less than 1.25μg/mL, the Q value in combination group were 0.94, 0.88, 0.86 and 0.89 respectively, which showed the additive effect of combination of these two drugs. ConclusionCompared with separate CDDP or THP, the combination of both CDDP and THP has more favorable inhibition of cell proliferation of brain glioma U87, with concentration dependent, which can achieve obviously tumor suppression effect under low dose, and has definitive coordination effect to kill and wound U87 cells.

[Key words] Brain glioma; MTT; Cis-Diaminedichloroplatinum(CDDP); Pirarubicins(THP); Proliferation腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外科最常見的惡性疾病，約占顱內(nèi)腫瘤的40％～50％[1]。腦膠質(zhì)瘤的治療方式以手術(shù)切除為主，術(shù)后常予以輔助性化療，其中以順鉑為主的聯(lián)合化療是其目前常用的一線治療方案[2,3]。由于腫瘤對(duì)化療藥的敏感性有很大差異，因此，腦膠質(zhì)瘤的最佳化療方案應(yīng)是針對(duì)不同腫瘤特征為依據(jù)，選擇較敏感化療藥進(jìn)行個(gè)體化綜合治療。本研究觀察了順鉑（CDDP）聯(lián)合吡柔比星（THP）對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87細(xì)胞的增殖抑制作用，探討兩藥在合適濃度下的協(xié)同抑制作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料

腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院腦外科實(shí)驗(yàn)室提供。胎牛血清、RPMI1640購于美國Sigma公司。CDDP、THP分別購于齊魯制藥公司（國藥準(zhǔn)字H37021358）和深圳萬樂藥業(yè)公司（國藥準(zhǔn)字H10930105）。MTT細(xì)胞增殖分析試劑為Promega公司產(chǎn)品，全波長酶標(biāo)儀為Thermo公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及試劑配置腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87細(xì)胞使用RPMI1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液，待U87細(xì)胞增殖融合達(dá)80%左右進(jìn)行消化傳代。CDDP用PBS液配制成1mg/mL的儲(chǔ)存液，THP用PBS液配制成1mg/mL儲(chǔ)存液，儲(chǔ)存于-70℃冰箱保存待用。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率[2] 取對(duì)數(shù)生長期的U87細(xì)胞，將U87細(xì)胞的濃度調(diào)至1.5×104/mL，每孔100μL接種于96孔板中，CDDP組、THP組、聯(lián)合組分別加入不同濃度（10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125）μg/mL的藥物（每個(gè)濃度各設(shè)3個(gè)復(fù)孔），其中聯(lián)合組根據(jù)兩藥同濃度進(jìn)行相互組合。另外設(shè)置細(xì)胞空白對(duì)照組、藥物單用組和聯(lián)合藥物組，各藥物組設(shè)6個(gè)濃度水平，采用常規(guī)MTT法測定U87細(xì)胞的增殖抑制率。

1.2.3 協(xié)同作用Q值的測定[4,5]根據(jù)金正均的概率和法計(jì)算其Q值，Q=E（A+B）/[EA + （1-EA）×EB]，其中E（A+B）、EA和EB分別為兩藥聯(lián)合作用時(shí)和兩藥單獨(dú)作用時(shí)的U87細(xì)胞增殖抑制率。當(dāng)計(jì)算的Q值為0.85～1.15時(shí)，表明兩藥聯(lián)合具有相加作用；當(dāng)計(jì)算的Q值>1.15時(shí)，兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用；當(dāng)計(jì)算的Q值<0.85時(shí)，表示兩藥聯(lián)合具有拮抗作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS18.0 for windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組內(nèi)和組間差異比較均采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測三組藥物培養(yǎng)48h時(shí)對(duì)U87細(xì)胞的增殖抑制率

培養(yǎng)48h時(shí)，隨著藥物濃度的增加，CDDP組、THP組和聯(lián)合組對(duì)U87細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）。聯(lián)合組對(duì)U87細(xì)胞增殖抑制率較同濃度CDDP組、THP組明顯增加， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。見表1。

2.2 CDDP和THP聯(lián)合用藥的協(xié)同作用結(jié)果分析

當(dāng)CDDP和THP濃度為0.3125μg/mL、0.625μg/mL時(shí)，聯(lián)合組的Q值分別為1.72、1.31，表示兩藥聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用（Q>1.15）；當(dāng)CDDP和THP濃度1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL時(shí)，聯(lián)合組的Q值分別為0.94、0.88、0.86、0.89，表示兩藥聯(lián)合應(yīng)用具有相加作用（Q值為0.85～1.15）。

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是腦外科較常見的原發(fā)性的腦部腫瘤，具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率和低治愈率的特點(diǎn)，預(yù)后相對(duì)較差，死亡率較高[6,7]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤主要來源于神經(jīng)間質(zhì)細(xì)胞，包括星形細(xì)胞瘤（Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅳ 級(jí)）、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤和混合型神經(jīng)膠質(zhì)瘤[8,9]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療方式以手術(shù)切除治療為主，但因神經(jīng)膠質(zhì)瘤其分化差、增殖快，常呈浸潤性生長，與正常的腦組織間邊界不是很清楚，多數(shù)不限于一個(gè)腦葉，向腦組織外呈指狀深入破壞腦組織,往往難以作到全部手術(shù)切除，一般均主張綜合治療[10-12]。目前臨床上一般主張進(jìn)行手術(shù)切除、術(shù)后放療和化療等綜合治療，尤其術(shù)后輔助化療是預(yù)防其復(fù)發(fā)的關(guān)鍵，以延緩其復(fù)發(fā)和延長患者的生存時(shí)間，而聯(lián)合用藥可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[13-15]。

CDDP是常用神經(jīng)腫瘤化療藥物之一，具有較強(qiáng)的抗癌活性，其機(jī)制主要是CDDP作為鉑的金屬絡(luò)合物，進(jìn)入癌細(xì)胞后逐漸水化成反式并水解，主要作用于DNA的鏈間和鏈內(nèi)的交鏈結(jié)構(gòu)，干擾癌細(xì)胞DNA的復(fù)制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡[16,17]。THP為細(xì)胞周期非特異性藥物，其機(jī)制主要是THP分子很快進(jìn)入核內(nèi)，抑制DNA聚合酶，阻止核酸合成；藥物嵌入DNA雙螺旋鏈，使腫瘤細(xì)胞中止于G2期，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在單用CDDP或THP進(jìn)行神經(jīng)膠質(zhì)瘤術(shù)后輔助化療時(shí)，臨床療效不甚滿意，這可能與腫瘤細(xì)胞的耐藥性有關(guān)。腫瘤耐藥機(jī)制與NF-κB的一些目標(biāo)基因包括炎性因子基因、抗凋亡基因和多藥耐藥基因等眾多影響細(xì)胞生長與凋亡的基因激活有關(guān)[18,19]。孫淑清等[20]證實(shí)腦膠質(zhì)瘤中P170、MGMT、TOPII等蛋白表達(dá)與化療藥物敏感性密切相關(guān)，可指導(dǎo)臨床選擇合理化療藥物。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨藥物濃度增加，CDDP組、THP組和聯(lián)合組對(duì)U87細(xì)胞增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，且聯(lián)合組對(duì)U87細(xì)胞增殖抑制率較同濃度CDDP組、THP組明顯增加，提示CDDP聯(lián)合THP較單純的CDDP或THP抑制U87細(xì)胞的增殖作用更強(qiáng)，具有濃度依賴性。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)CDDP和THP濃度為≤0.625μg/mL時(shí)，Q>1.15，提示CDDP聯(lián)合THP兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用；當(dāng)CDDP和THP濃度≥1.25μg/mL時(shí)，Q值為0.85～1.15，提示CDDP聯(lián)合THP具有相加作用。

總之，CDDP聯(lián)合THP較單純的CDDP或THP抑制U87細(xì)胞的增殖作用更強(qiáng)，具有濃度依賴性。在較低劑量下就能達(dá)到明顯腫瘤抑制效應(yīng)，對(duì)殺傷U87細(xì)胞具有確切協(xié)同效應(yīng)。

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（收稿日期：2013-12-17）