孫清榮+王金政+薛曉敏+孫洪雁

摘 要：為了建立杏新品種 ‘金凱特（Prunus armeniaca Lam.）的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系，以其當(dāng)年生半木質(zhì)化綠枝莖段為材料，研究了基本培養(yǎng)基、外源植物生長(zhǎng)物質(zhì)及蔗糖濃度對(duì)腋芽啟動(dòng)、試管苗繼代增殖及生根的影響。結(jié)果表明，腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)時(shí)，MS培養(yǎng)基較QL培養(yǎng)基更有利于腋芽的萌發(fā)生長(zhǎng)，在添加1.0 mg/L BA和0.2 mg/L IBA的MS培養(yǎng)基上，腋芽萌發(fā)率達(dá)85.8%。試管苗的繼代增殖培養(yǎng)基以WPM最佳，其次為MS，QL最差。生根培養(yǎng)基以MS最有效，1/2MS和1/2QL均不能誘導(dǎo)根的產(chǎn)生；蔗糖濃度20 g/L比30 g/L顯著提高了生根率；最佳生根培養(yǎng)基為MS + 2 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖，生根率為93.2%，平均每株生根數(shù)為2.5。

關(guān)鍵詞：金凱特杏；組織培養(yǎng)與快繁；腋芽啟動(dòng)；增殖；生根誘導(dǎo)

中圖分類號(hào)：S662.204+.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）12-0025-04

Abstract In order to establish the technological system of tissue culture and rapid proliferation of apricot new variety ‘Jinkaite （Prunus armeniaca Lam.）， the current half-lignified branches were selected as materials to study the effects of basal media， plant growth regulators and sucrose concentrations on axillary bud initiation， in vitro shoots proliferation and rooting were examined. The results showed that the basal medium MS was more effective than QL for axillary bud initiation and growth. The highest germination rate of axillary bud was obtained on the MS with 1.0 mg/L BA and 0.2 mg/L IBA， which reached 85.8%. For proliferation， the basal medium WPM was the best followed by MS， and QL was the poorest. For rooting， MS was the most effective， and 1/2MS and 1/2QL failed to induce rooting. The concentration of sucrose as 20 g/L significantly improved the rooting rate compared to 30 g/L. The optimal rooting medium was MS + 2 mg/L IBA + 20 g/L sucrose with the rooting rate as 93.2%， and the average root number per plantlet was 2.5.

Keywords ‘Jinkaite Apricot； Tissue culture and rapid proliferation； Axillary bud initiation； Proliferation； Root induction

杏（Prunus armeniaca Lam.）果實(shí)含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)元素、維生素和氨基酸，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的水果，深受人們喜愛(ài)。但大多數(shù)杏栽培品種經(jīng)常受到由細(xì)菌、真菌及病毒等引起的病害威脅[1-4]。病毒病會(huì)造成果樹(shù)生長(zhǎng)勢(shì)衰弱，產(chǎn)量降低，果實(shí)品質(zhì)下降，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致樹(shù)體枯死[5]。培育無(wú)病毒（嚴(yán)格說(shuō)應(yīng)是無(wú)特種病毒）種苗是防治病毒病害的最有效措施。無(wú)病毒種苗的生產(chǎn)與保存，是現(xiàn)代果業(yè)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)苗木的基礎(chǔ)。組織培養(yǎng)方法脫除果樹(shù)病毒已在國(guó)內(nèi)外得到了廣泛應(yīng)用[5]。因此，以無(wú)性繁殖方式進(jìn)行果樹(shù)種苗繁育，成功建立其組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系，是進(jìn)行良種苗木脫毒研究及無(wú)病毒苗木培育的基礎(chǔ)，也是實(shí)現(xiàn)良種苗木快繁及無(wú)病毒苗工廠化育苗的基礎(chǔ)。杏樹(shù)組培快繁技術(shù)體系的建立，對(duì)優(yōu)特異種質(zhì)資源的離體保存及利用現(xiàn)代生物技術(shù)育種方法改良品種都具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

果樹(shù)的組織培養(yǎng)研究中，桃、杏、李等核果類果樹(shù)落后于蘋(píng)果、梨等仁果類果樹(shù)，被認(rèn)為是組織培養(yǎng)較困難的種類之一。有關(guān)杏的組織培養(yǎng)已有成功的報(bào)道[6，7]，但都存在繁殖系數(shù)低或生根率低的問(wèn)題，且不同基因型的適宜組培條件存在差異?！饎P特杏是山東省果樹(shù)研究所從‘凱特杏的自然雜交實(shí)生種中選出的早熟優(yōu)良新品種[8]。該品種具有早熟、果大、優(yōu)質(zhì)、耐貯及自花結(jié)實(shí)等特點(diǎn)，具有較高的商業(yè)生產(chǎn)價(jià)值。本試驗(yàn)建立了‘金凱特杏組培快繁技術(shù)體系，以期為該優(yōu)良品種的病毒脫除、無(wú)病毒苗木的生產(chǎn)及利用生物技術(shù)進(jìn)行品種改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

山東省果樹(shù)研究所苗圃種植的‘金凱特杏成年大樹(shù)。

1.2 方法

1.2.1 無(wú)菌苗的獲得 2012年5月，從成年大樹(shù)上剪取健壯無(wú)病蟲(chóng)害的半木質(zhì)化枝條，去掉葉片后剪成一芽一段的芽段。將芽段用洗衣粉水清洗后，自來(lái)水流水沖洗30 min以上，置于超凈工作臺(tái)上的無(wú)菌燒杯中，先用70%酒精殺菌1 min，再用5%次氯酸鈉溶液殺菌8 min，期間搖動(dòng)5～8次，最后用無(wú)菌水洗4～5次，接種到裝有芽啟動(dòng)培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)。

芽啟動(dòng)培養(yǎng)基為分別添加1.0 mg/L BA和0.2 mg/L IBA的MS、QL和WPM培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基均添加3%蔗糖和0.6%瓊脂，滅菌前調(diào)pH值5.8。每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種4個(gè)外植體。接種后置于光周期為16 h/8 h （光/暗）、培養(yǎng)溫度為（25±2）℃的培養(yǎng)室培養(yǎng)。培養(yǎng)4周時(shí)統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)率（腋芽萌發(fā)芽段數(shù)/接種總芽段數(shù)×100%）。腋芽萌發(fā)并伸長(zhǎng)生長(zhǎng)形成的綠梢用作增殖試驗(yàn)的材料。

1.2.2 無(wú)菌苗的增殖 腋芽萌發(fā)獲得無(wú)菌苗后，轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

試驗(yàn)1：共設(shè)3個(gè)增殖培養(yǎng)基處理，基本培養(yǎng)基為QL、1/2MS及1/2QL+1/2MS，分別添加1.0 mg/L BA和0.1mg/L IBA。

試驗(yàn)2：將試驗(yàn)1獲得的無(wú)菌苗用做本試驗(yàn)繼代增殖的材料?；九囵B(yǎng)基為MS、QL和WPM，分別添加0.5 mg/L BA、0.05 mg/L IBA和0.5 mg/L GA3，共3個(gè)處理。每處理接種5瓶，每瓶接種5個(gè)外植體。每4周繼代一次并記錄外植體的新增梢數(shù)，共繼代培養(yǎng)3次，取其平均值作為每個(gè)處理每個(gè)繼代周期的增殖梢數(shù)。重復(fù)2次。

1.2.3 無(wú)菌苗生根誘導(dǎo) 將增殖培養(yǎng)基上1.5 cm以上的健壯綠梢轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根誘導(dǎo)。生根培養(yǎng)基為添加1 mg/L IBA和20 g/L蔗糖的1/2QL和1/2MS培養(yǎng)基及分別添加1、2 mg/L IBA及20、30 g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基，共6個(gè)處理（見(jiàn)表2）。接種后暗培養(yǎng)1周，轉(zhuǎn)移至光照條件下培養(yǎng)，光周期為16 h/8 h（光/暗）。培養(yǎng)4周時(shí)統(tǒng)計(jì)生根株數(shù)及每株根數(shù)，計(jì)算生根率和平均每株根數(shù)。生根率（%）=生根梢數(shù)/接種總梢數(shù)×100；平均每株根數(shù)=生根植株的總根數(shù)/生根植株數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS v 3.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同處理平均值采用LSD法進(jìn)行顯著性差異比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)菌苗的獲得

三種啟動(dòng)培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)芽段的腋芽萌發(fā)（圖1A），但不同培養(yǎng)基上的萌發(fā)率不同，MS培養(yǎng)基上萌發(fā)率最高，達(dá)85.8%；其次為QL培養(yǎng)基，為50.1%；WPM培養(yǎng)基最低，僅為29.8%（資料沒(méi)有列出）。表明MS基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)‘金凱特杏半木質(zhì)化莖段上的腋芽萌發(fā)最有效。

2.2 無(wú)菌苗的增殖

試驗(yàn)1的三種不同培養(yǎng)基處理均有芽的增殖，但均表現(xiàn)為芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)很差或不伸長(zhǎng)（圖1B、C和D）。表明這三種培養(yǎng)基均不適宜于‘金凱特杏無(wú)菌苗的增殖培養(yǎng)。

試驗(yàn)2的不同培養(yǎng)基處理上均獲得了伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的綠梢，且各處理均明顯優(yōu)于試驗(yàn)1，但不同培養(yǎng)基上的增殖倍數(shù)和伸長(zhǎng)梢的生長(zhǎng)情況不同。由表1可見(jiàn)，基本培養(yǎng)基為MS和WPM的處理平均增殖梢差異不顯著，但顯著高于QL培養(yǎng)基處理。由圖1可以看出，WPM培養(yǎng)基上產(chǎn)生的有效梢最多，長(zhǎng)勢(shì)最壯，葉綠且大，沒(méi)有枯頂現(xiàn)象（圖1E）；其次為MS培養(yǎng)基（圖1G、H）；QL培養(yǎng)基最差（圖1I），產(chǎn)生的有效梢較少，且有枯頂現(xiàn)象發(fā)生（圖1J）。表明WPM培養(yǎng)基是‘金凱特杏增殖快繁及新梢生長(zhǎng)的最適宜培養(yǎng)基。但WPM培養(yǎng)基上的新梢培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（6周以上）時(shí)，會(huì)出現(xiàn)黃化或白化現(xiàn)象（圖1F）。因此‘金凱特杏繼代增殖培養(yǎng)時(shí)，較宜選用WPM+0.5 mg/L BA+0.05 mg/L IBA+0.5 mg/L GA3培養(yǎng)基，繼代周期時(shí)長(zhǎng)應(yīng)控制在6周以內(nèi)。

2.3 無(wú)菌苗生根

由表2可見(jiàn)，添加不同濃度IBA和蔗糖的MS培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)‘金凱特杏新梢生根，但四種不同MS培養(yǎng)基上生根率差異顯著。其中，MS+2 mg/L IBA+20 g/L蔗糖培養(yǎng)基上的新梢生根率最高，顯著高于其它處理；其新梢平均生根數(shù)也最高，與MS+1 mg/L IBA+20 g/L蔗糖和MS+2 mg/L IBA+30 g/L蔗糖培養(yǎng)基差異不顯著，但顯著高于MS+2 mg/L IBA+30 g/L蔗糖培養(yǎng)基。而添加1 mg/L IBA和20 g/L蔗糖的1/2MS和1/2QL培養(yǎng)基均不能誘導(dǎo)‘金凱特杏新梢生根。從根的生長(zhǎng)情況來(lái)看，高濃度的IBA（2 mg/L）較低濃度的IBA（1 mg/L）更易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織（圖1K和L）。綜合分析可得，‘金凱特杏試管苗最適宜的生根培養(yǎng)基為MS+2 mg/L IBA+20 g/L，培養(yǎng)時(shí)間控制在5周以內(nèi)，防止根上過(guò)多產(chǎn)生愈傷組織。

3 討論和結(jié)論

以半木質(zhì)化綠枝芽段為外植體進(jìn)行無(wú)菌苗的啟動(dòng)培養(yǎng)，是多年生木本植物獲得無(wú)菌苗的一種行之有效的方法[5-7]，但啟動(dòng)培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)基條件因基因型不同而不同。研究表明，‘龍王帽和‘紅荷包杏啟動(dòng)培養(yǎng)的適宜基本培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基[6，12]，但添加的外源植物生長(zhǎng)物質(zhì)不同，前者為0.5 mg/L BA和0.2 mg/L IBA，后者為0.25 mg/L BA和0.01 mg/L IBA。而‘Bebecou 杏啟動(dòng)培養(yǎng)的適宜基本培養(yǎng)基為Balla培養(yǎng)基[13]。本研究中 ‘金凱特杏的啟動(dòng)培養(yǎng)基以添加1.0 mg/L BA和0.2 mg/L IBA的MS培養(yǎng)基效果最佳，腋芽萌發(fā)率最高，但所添加的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)不同。表明基因型不同的相似外植體，其適宜的啟動(dòng)培養(yǎng)基也不同。

基本培養(yǎng)基的組成對(duì)試管苗的增殖具有重要影響。不同品種杏的適宜增殖培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基組成不同。品種‘El-Hamawey在WPM上獲得了良好的增殖和伸長(zhǎng)生長(zhǎng)[14]；品種‘Currot、‘Helena和‘Lorna在QL培養(yǎng)基上增殖和伸長(zhǎng)生長(zhǎng)最佳[15]；品種‘龍王帽在NN69培養(yǎng)基上的增殖和伸長(zhǎng)生長(zhǎng)最佳[6]。本研究中‘金凱特杏試管苗的適宜增殖培養(yǎng)基為WPM，在該培養(yǎng)基上既可獲得較高的增殖效率，又可獲得較高的有效梢數(shù)（可用于生根的伸長(zhǎng)梢數(shù)）。但在WPM上的繼代培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)控制在6周以內(nèi)，以防黃化或白化苗的發(fā)生。

生根誘導(dǎo)是組培快繁的一個(gè)重要步驟。生根難或生根率低是組培快繁的一個(gè)重要障礙。本研究中利用全量MS添加2 mg/L IBA誘導(dǎo)‘金凱特杏獲得了較高的生根率（93.2%），這與前人報(bào)道的1/2或1/3基本培養(yǎng)基可提高生根率的結(jié)果不同[6，13]，而與‘Helena杏用全量QL比1/3QL更有利于生根的結(jié)果相似[15]。本研究中雖然較高濃度IBA（2 mg/L）比較低濃度（1 mg/L）更有利于提高生根率，但隨著生根誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間的增加，較高濃度IBA上產(chǎn)生的根易產(chǎn)生愈傷，較多的愈傷會(huì)影響移栽成活率。因此生根培養(yǎng)時(shí)間控制在5周以內(nèi)，可誘導(dǎo)‘金凱特杏達(dá)到理想的生根效果。

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