不同產(chǎn)地桑葉藥材UPLC指紋圖譜研究

彭麗英+彭攸靈+楊先國

[摘要] 目的 建立不同產(chǎn)地桑葉UPLC指紋圖譜。 方法 采用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50.0 mm，1.7 μm）色譜柱，流動相為甲醇-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫，檢測波長為358 nm，流速為0.6 ml/min，柱溫40℃，進樣體積1 μl。 結果 建立了桑葉專屬性的UPLC指紋圖譜，確定了15個共有峰，不同產(chǎn)地桑葉樣品具有較好的相似度。結論 UPLC指紋圖譜方法重復性好，簡便可靠，可用于桑葉的快速鑒別，可以為桑葉的質量控制和市場應用提供依據(jù)。

[關鍵詞] 桑葉；指紋圖譜；超高效液相色譜法

[中圖分類號] R286[文獻標識碼] A[文章編號] 1674-4721（2014）05（b）-0008-04

Study on UPLC fingerprint of Morus alba L. from different regions

PENG Li-ying PENG You-ling YANG Xian-guo▲

Hunan Traditional Chinese Medical College,Zhuzhou412012,China

[Abstract] Objective To establish UPLC fingerprint of Morus alba L. from different regions. Methods Column ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50.0 mm,1.7 μm)was used.The mobile phase was methanol-0.2％ phosphoric acid water with gradient elution.The detection wave-lengths was 358 nm and column temperature was 40℃ with the flow rate of 0.6 ml/min.The sample injection was 1 μl. Results A specificity fingerprint chromatogram was produced and 15 characteristic peaks were designated.The results showed that the collected samples had a good similarity. Conclusion UPLC fingerprint is a reliable,available and quick method of quality control of Morus alba L. and it is necessary for the safe and practicable use of the medicine.

[Key words] Morus alba L.;Fingerprint;UPLC

桑葉為桑科植物桑（Morus alba L.）的葉，初露后采收，除去雜質，曬干，具有疏散風熱、清肺潤燥、清肝明目的功效，主要用于風熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭痛、目赤昏花[1]。桑葉藥食兩用，現(xiàn)代研究表明桑葉具有降血糖[2-4]、降血壓[5]、降血脂、抗炎、抗衰老[6]、抗腫瘤[7]等功效，在藥用和食品保健方面都發(fā)揮了重要作用。目前，桑葉的質量控制主要集中于蘆丁和綠原酸含量的測定[8-12]，除蘆丁外，其他黃酮類化合物也是桑葉質量控制的熱點[13-16]。隨著國內外市場對桑葉的需求愈來愈大，桑葉的質量也參差不齊。課題組認為中藥是多成分、多環(huán)節(jié)、多靶點的藥物，質量控制也需要體現(xiàn)中藥特色，僅靠單一或幾個指標難以衡量質量的優(yōu)劣。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段，是建立在中藥化學成分系統(tǒng)研究的基礎上，主要用于評價中藥材及中藥制劑半成品質量的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性，符合中醫(yī)中藥整體性和模糊性的特點[17]。課題組為了進一步控制桑葉質量，采用UPLC方法，對從全國收集的桑葉藥材進行指紋圖譜進行研究。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

KQ-100B型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；JA51002型電子分析天平（島津）；Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜系統(tǒng)，Empower工作站，含四元梯度泵、自動進樣器、紫外檢測器（Waters公司）。

1.2 試劑

甲醇（色譜純，TEDIA公司），乙腈（色譜純，TEDIA公司），水為娃哈哈純凈水，磷酸（色譜純，北京化工廠）。

1.3 對照品及藥材

對照品異槲皮苷和紫云英苷，購于成都植標化純生物技術有限公司，供含量測定用，批號分別為PCS0371-lot 120510和PCS0468-lot 120328；對照品蘆丁購于中國食品藥品檢定研究院，批號為0080-9705。不同產(chǎn)地的桑葉藥材11批，均由湖南中醫(yī)藥大學生藥學教研室潘清平教授鑒定為桑科植物桑（Morus alba L.）的葉，藥材批號及來源見表1。

表1 桑葉藥材批號及來源

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50.0 mm，1.7 μm）；流速：0.6 ml/min；檢測波長：358 nm；柱溫：40℃；進樣體積：1 μl；流動相：甲醇（A）-0.2%磷酸水（B）梯度洗脫，洗脫程序：0→22 min，10%A→32%A。

2.2 供試品溶液的制備

藥材粉碎，過60目篩，取藥粉約0.5 g，精密稱定，置于100 ml三角瓶中，加入75%甲醇50 ml，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）30 min，放冷，用75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取對照品異槲皮苷、蘆丁和紫云英苷適量，用75%甲醇溶解，定容，得到其濃度分別為0.092、0.042、0.054 μg/μl。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗取同一批桑葉供試品（20080305），按照2.2項的方法制備供試品溶液1份，按照上述色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定指紋圖譜。以10號峰（圖1）的保留時間和峰面積為參照，計算樣品中所含15個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。各共有峰的相對保留時間的RSD＜0.5％，相對峰面積的RSD＜1.0％，表明儀器的精密度良好。

圖1 桑葉藥材共有模式指紋圖譜

2.4.2 重復性試驗按上述方法平行制備同一批桑葉供試品（20080305），測定指紋圖譜?？疾鞓悠分兴?5個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，各色譜峰的相對保留時間的RSD＜0.5%，相對峰面積的RSD＜1.0％，提示方法的重復性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗同一批桑葉供試品（20080305）溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定，以各峰的相對保留時間和相對峰面積進行考察，桑葉樣品24 h各色譜峰的相對保留時間的RSD＜0.5％，相對峰面積的RSD＜1.0％，表明桑葉樣品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 指紋圖譜共有模式的建立取桑葉藥材樣品11批，按照2.2下方法制備供試品溶液，分別進樣1 μl，記錄UPLC色譜圖。采用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2.0版）進行分析，生成共有模式指紋圖譜，有15個共有峰（圖1），其中以峰10（S峰）為參照物，其余各共有峰與峰10的相對保留時間與相對保留面積見表2。

2.5.2 共有峰的確定11批桑葉藥材樣品導入軟件，得共有指紋圖譜（圖2），對照品溶液的色譜圖見圖3，經(jīng)與對照品對照，指認10、11、12號峰分別為異槲皮苷、蘆丁、紫云英苷。

2.5.3 指紋圖譜的相似度評價上述11批桑葉樣品相似度計算結果依次為0.970、0.968、0.967、0.896、0.941、0.983、0.983、0.918、0.964、0.994、0.989、0.989，以上數(shù)據(jù)表明桑葉各批次相似性較好。

3 討論

本次實驗選用UPLC開展桑葉指紋圖譜研究，與HPLC相比，UPLC方法快速簡便、穩(wěn)定可靠。本次桑葉指紋圖譜實驗分析時間在22 min內，更加快捷和節(jié)約溶劑。

本實驗根據(jù)桑葉中主要成分為黃酮類、酚酸類化合物，在75%甲醇中有相對較好的溶解度，選擇75%甲醇超聲，樣品前處理簡單、可控；樣品呈弱酸性，選擇極低濃度的磷酸水溶液作為水相；選擇甲醇作為有機相來分析中藥桑葉，與乙腈相比更加安全和便宜；波長選擇358 nm也是基于主要化合物在該波長處吸收相對最大，且雜質干擾較少；梯度選擇均一梯度變化以保證樣品具有更好的重復性。

相似度結果表明，不同批次桑葉樣品相似度計算結果均＞0.85，表明所收集的桑葉藥材質量相對均一穩(wěn)定，當然也與藥用桑葉樣品只有一種來源有關。

[參考文獻]

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部[M].北京：化學工業(yè)出版社，2010：279.

[2]李超，潘建明，羅新根，等.桑葉消渴膠囊對2型糖尿病大鼠的影響[J].海南醫(yī)學，2012，23（2）：18-20.

[3]陳建國，步文磊.桑葉多糖降糖作用及其機制研究[J].中草藥，2011，42（3）：515-520.

[4]羅存敏.桑葉提取物對小鼠血糖的影響及其有效成份測定[J].蠶業(yè)科學，2005，31（4）：418-421.

[5]閻百傳.霜桑葉穩(wěn)定了我的血壓[J].長壽，2008，（12）：43.

[6]王燦，左艇，王琳琳.桑葉黃酮抗皮膚衰老實驗研究[J].中國醫(yī)藥導報，2011，8（3）：30-32.

[7]楊燕，王洪慶，陳若蕓.桑葉中的黃酮類化合物[J].藥學學報，2010，（1）：77-81.

[8]周美環(huán)，趙書楷，陳淼，等.HPLC法測定桑葉中蘆丁的含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2010，12（5）：228-229.

[9]雷霖，何健飛.高效液相色譜法測定桑葉中蘆丁的含量[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2012，22（3）：468-469.

[10]郭紅霞，謝文劍，曹藝，等.RP-HPLC測定桑葉中綠原酸的含量[J].中國當代醫(yī)藥，2014，21（4）：17-19.

[11]徐韌柳，李麗華，康懷萍.RP-HPLC測定桑葉中綠原酸的含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2005，12（1）：53-54.

[12]孫蓮，張麗靜，孟磊，等.RP-HPLC法測定桑葉中綠原酸的含量[J].中草藥，2003，34（1）：78-79.

[13]嚴安定，袁野，吳亮，等.HPLC法同時測定桑葉中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷的含量[J].安徽醫(yī)藥，2011，15（3）：296-298.

[14]吳羽艷.桑葉中總黃酮的含量測定方法研究[J].輕工科技，2013，（4）：43-44.

[15]張亮亮，汪詠梅，徐曼，等.不同品種桑葉多酚和黃酮含量變化規(guī)律研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2013，24（5）：1064-1066.

[16]張強，孫長波，張晶.桑葉中多糖和總黃酮的含量測定[J].吉林農業(yè)·學術版，2011，（3）：73-74.

[17]李強，杜思邈，張忠亮，等.中藥指紋圖譜技術進展及未來發(fā)展方向展望[J].中草藥，2013，44（22）：3095-3104.

（收稿日期：2014-04-08本文編輯：李亞聰）

[作者簡介] 彭麗英（1977-），女，湖南懷化人，本科，主管中藥師，主要從事中藥鑒定與中藥調劑、中藥質量標準的教學與科研工作

▲通訊作者：楊先國（1977-），男，湖南桃源人，講師，博士，主要研究方向為中藥鑒定與質量控制研究

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 指紋圖譜共有模式的建立取桑葉藥材樣品11批，按照2.2下方法制備供試品溶液，分別進樣1 μl，記錄UPLC色譜圖。采用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2.0版）進行分析，生成共有模式指紋圖譜，有15個共有峰（圖1），其中以峰10（S峰）為參照物，其余各共有峰與峰10的相對保留時間與相對保留面積見表2。

2.5.2 共有峰的確定11批桑葉藥材樣品導入軟件，得共有指紋圖譜（圖2），對照品溶液的色譜圖見圖3，經(jīng)與對照品對照，指認10、11、12號峰分別為異槲皮苷、蘆丁、紫云英苷。

2.5.3 指紋圖譜的相似度評價上述11批桑葉樣品相似度計算結果依次為0.970、0.968、0.967、0.896、0.941、0.983、0.983、0.918、0.964、0.994、0.989、0.989，以上數(shù)據(jù)表明桑葉各批次相似性較好。

3 討論

本次實驗選用UPLC開展桑葉指紋圖譜研究，與HPLC相比，UPLC方法快速簡便、穩(wěn)定可靠。本次桑葉指紋圖譜實驗分析時間在22 min內，更加快捷和節(jié)約溶劑。

本實驗根據(jù)桑葉中主要成分為黃酮類、酚酸類化合物，在75%甲醇中有相對較好的溶解度，選擇75%甲醇超聲，樣品前處理簡單、可控；樣品呈弱酸性，選擇極低濃度的磷酸水溶液作為水相；選擇甲醇作為有機相來分析中藥桑葉，與乙腈相比更加安全和便宜；波長選擇358 nm也是基于主要化合物在該波長處吸收相對最大，且雜質干擾較少；梯度選擇均一梯度變化以保證樣品具有更好的重復性。

相似度結果表明，不同批次桑葉樣品相似度計算結果均＞0.85，表明所收集的桑葉藥材質量相對均一穩(wěn)定，當然也與藥用桑葉樣品只有一種來源有關。

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[6]王燦，左艇，王琳琳.桑葉黃酮抗皮膚衰老實驗研究[J].中國醫(yī)藥導報，2011，8（3）：30-32.

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[8]周美環(huán)，趙書楷，陳淼，等.HPLC法測定桑葉中蘆丁的含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2010，12（5）：228-229.

[9]雷霖，何健飛.高效液相色譜法測定桑葉中蘆丁的含量[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2012，22（3）：468-469.

[10]郭紅霞，謝文劍，曹藝，等.RP-HPLC測定桑葉中綠原酸的含量[J].中國當代醫(yī)藥，2014，21（4）：17-19.

[11]徐韌柳，李麗華，康懷萍.RP-HPLC測定桑葉中綠原酸的含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2005，12（1）：53-54.

[12]孫蓮，張麗靜，孟磊，等.RP-HPLC法測定桑葉中綠原酸的含量[J].中草藥，2003，34（1）：78-79.

[13]嚴安定，袁野，吳亮，等.HPLC法同時測定桑葉中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷的含量[J].安徽醫(yī)藥，2011，15（3）：296-298.

[14]吳羽艷.桑葉中總黃酮的含量測定方法研究[J].輕工科技，2013，（4）：43-44.

[15]張亮亮，汪詠梅，徐曼，等.不同品種桑葉多酚和黃酮含量變化規(guī)律研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2013，24（5）：1064-1066.

[16]張強，孫長波，張晶.桑葉中多糖和總黃酮的含量測定[J].吉林農業(yè)·學術版，2011，（3）：73-74.

[17]李強，杜思邈，張忠亮，等.中藥指紋圖譜技術進展及未來發(fā)展方向展望[J].中草藥，2013，44（22）：3095-3104.

（收稿日期：2014-04-08本文編輯：李亞聰）

[作者簡介] 彭麗英（1977-），女，湖南懷化人，本科，主管中藥師，主要從事中藥鑒定與中藥調劑、中藥質量標準的教學與科研工作

▲通訊作者：楊先國（1977-），男，湖南桃源人，講師，博士，主要研究方向為中藥鑒定與質量控制研究

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 指紋圖譜共有模式的建立取桑葉藥材樣品11批，按照2.2下方法制備供試品溶液，分別進樣1 μl，記錄UPLC色譜圖。采用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2.0版）進行分析，生成共有模式指紋圖譜，有15個共有峰（圖1），其中以峰10（S峰）為參照物，其余各共有峰與峰10的相對保留時間與相對保留面積見表2。

2.5.2 共有峰的確定11批桑葉藥材樣品導入軟件，得共有指紋圖譜（圖2），對照品溶液的色譜圖見圖3，經(jīng)與對照品對照，指認10、11、12號峰分別為異槲皮苷、蘆丁、紫云英苷。

2.5.3 指紋圖譜的相似度評價上述11批桑葉樣品相似度計算結果依次為0.970、0.968、0.967、0.896、0.941、0.983、0.983、0.918、0.964、0.994、0.989、0.989，以上數(shù)據(jù)表明桑葉各批次相似性較好。

3 討論

本次實驗選用UPLC開展桑葉指紋圖譜研究，與HPLC相比，UPLC方法快速簡便、穩(wěn)定可靠。本次桑葉指紋圖譜實驗分析時間在22 min內，更加快捷和節(jié)約溶劑。

本實驗根據(jù)桑葉中主要成分為黃酮類、酚酸類化合物，在75%甲醇中有相對較好的溶解度，選擇75%甲醇超聲，樣品前處理簡單、可控；樣品呈弱酸性，選擇極低濃度的磷酸水溶液作為水相；選擇甲醇作為有機相來分析中藥桑葉，與乙腈相比更加安全和便宜；波長選擇358 nm也是基于主要化合物在該波長處吸收相對最大，且雜質干擾較少；梯度選擇均一梯度變化以保證樣品具有更好的重復性。

相似度結果表明，不同批次桑葉樣品相似度計算結果均＞0.85，表明所收集的桑葉藥材質量相對均一穩(wěn)定，當然也與藥用桑葉樣品只有一種來源有關。

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[5]閻百傳.霜桑葉穩(wěn)定了我的血壓[J].長壽，2008，（12）：43.

[6]王燦，左艇，王琳琳.桑葉黃酮抗皮膚衰老實驗研究[J].中國醫(yī)藥導報，2011，8（3）：30-32.

[7]楊燕，王洪慶，陳若蕓.桑葉中的黃酮類化合物[J].藥學學報，2010，（1）：77-81.

[8]周美環(huán)，趙書楷，陳淼，等.HPLC法測定桑葉中蘆丁的含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2010，12（5）：228-229.

[9]雷霖，何健飛.高效液相色譜法測定桑葉中蘆丁的含量[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2012，22（3）：468-469.

[10]郭紅霞，謝文劍，曹藝，等.RP-HPLC測定桑葉中綠原酸的含量[J].中國當代醫(yī)藥，2014，21（4）：17-19.

[11]徐韌柳，李麗華，康懷萍.RP-HPLC測定桑葉中綠原酸的含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2005，12（1）：53-54.

[12]孫蓮，張麗靜，孟磊，等.RP-HPLC法測定桑葉中綠原酸的含量[J].中草藥，2003，34（1）：78-79.

[13]嚴安定，袁野，吳亮，等.HPLC法同時測定桑葉中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷的含量[J].安徽醫(yī)藥，2011，15（3）：296-298.

[14]吳羽艷.桑葉中總黃酮的含量測定方法研究[J].輕工科技，2013，（4）：43-44.

[15]張亮亮，汪詠梅，徐曼，等.不同品種桑葉多酚和黃酮含量變化規(guī)律研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2013，24（5）：1064-1066.

[16]張強，孫長波，張晶.桑葉中多糖和總黃酮的含量測定[J].吉林農業(yè)·學術版，2011，（3）：73-74.

[17]李強，杜思邈，張忠亮，等.中藥指紋圖譜技術進展及未來發(fā)展方向展望[J].中草藥，2013，44（22）：3095-3104.

（收稿日期：2014-04-08本文編輯：李亞聰）

[作者簡介] 彭麗英（1977-），女，湖南懷化人，本科，主管中藥師，主要從事中藥鑒定與中藥調劑、中藥質量標準的教學與科研工作

▲通訊作者：楊先國（1977-），男，湖南桃源人，講師，博士，主要研究方向為中藥鑒定與質量控制研究