黃 海， 賴義明， 何 旺， 董 文， 朱定軍， 張一鳴， 劉 皓， 于 浩， 畢良寬， 林天歆， 黃 健， 郭正輝， 杜 濤

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 1泌尿外科， 2產(chǎn)前診斷中心，廣東 廣州 510120)

前列腺特異性膜抗原(prostate-specific membrane antigen, PSMA)是一種前列腺上皮細(xì)胞Ⅱ型跨膜糖蛋白，由前列腺上皮細(xì)胞分泌，其氨基端位于細(xì)胞膜內(nèi)，分子量約為100 kD，共含750個氨基酸，其中胞外段707個，跨膜段24個，胞內(nèi)段19個。PSMA表達(dá)水平與前列腺癌病情的進(jìn)展有明顯相關(guān)性，是前列腺癌天然的靶點，在前列腺癌診治及研究中有重大意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PSMA具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞遷移、受體效應(yīng)、營養(yǎng)攝取等功能[1-2]。其中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制并非完全清楚。c-Jun氨基末端激酶/應(yīng)激激活的蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase/stress activated protein kinases, JNK/SAPK)信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要信號通路之一，在細(xì)胞增殖及凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并與人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。本研究中，我們以阻斷或增強(qiáng)PSMA表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞LNCaP細(xì)胞株作為研究對象，在一般培養(yǎng)基及JNK/SAPK信號通路抑制劑SP600125作用下，發(fā)現(xiàn)在LNCaP細(xì)胞PSMA的表達(dá)與p-JNK/SAPK水平及細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期具有一定聯(lián)系，推測PSMA可能通過JNK/SAPK信號通路對前列腺癌的增殖及凋亡起到調(diào)控作用。

材 料 和 方 法

1 材料

利用前期研究中建立的高效阻斷PSMA表達(dá)的shRNA慢病毒載體，阻斷前列腺癌細(xì)胞中PSMA的表達(dá)作為實驗的干擾組(shPSMA)[4]；同時利用前期構(gòu)建的PSMA真核表達(dá)載體pcDNA3.1-PSMA轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞中PSMA的表達(dá)作為陽性實驗組(pcDNA-PSMA)[5-6]；不做任何處理的LNCaP細(xì)胞株(購自中山大學(xué)實驗動物中心)作為空白組(control)；加入JNK/SAPK抑制劑SP600125作為陰性對照研究。

RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(HyClone)；0.25%胰酶(吉瑪公司)；Cell Counting Kit-8(Dojindo Laboratories)；兔抗人磷酸化JNK多克隆抗體(CST)；兔抗人PSMA單克隆抗體(Abcam)；3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)內(nèi)參照抗體(Santa)；辣根過氧化物酶(peroxidase horseradish, HRP)標(biāo)記的羊抗兔抗體(ICL)； SP600125 (CST)；BCA法蛋白定量試劑盒(上海申能博采)；柯達(dá)黑白膠片；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒(Thermo)；超敏ECL試劑盒(Millipore)；免疫組化染色試劑盒和濃縮型DAB試劑盒(中杉金橋)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Keygen)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 各組細(xì)胞分別于含100 mL/L FBS、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；細(xì)胞每2 d換液，約5～6 d(細(xì)胞80%融合后)按1∶4傳代，每天觀察記錄掌握細(xì)胞基本生長規(guī)律。SP600125溶于DMSO中(25 mmol/L)，分裝備用。部分細(xì)胞凍存，備以下實驗用。

2.2細(xì)胞內(nèi)JNK/SAPK蛋白磷酸化水平檢測

2.2.1Western blotting 各組細(xì)胞按每孔3×106個細(xì)胞種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后予無血清RPMI-1640培養(yǎng)基換液。24 h后，一部分細(xì)胞予同樣無血清培養(yǎng)基換液，另一部分細(xì)胞予含25 μmol/L SP600125的無血清培養(yǎng)基更換，全部細(xì)胞再于培養(yǎng)箱中孵育30 min，即用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量，12% SDS-PAGE行3組細(xì)胞PSMA和磷酸化JNK蛋白分離，轉(zhuǎn)于PVDF膜上，封閉后，孵PSMA(1∶1 000)Ⅰ抗、p-JNK(1∶1 500)Ⅰ抗和GAPDH (1∶10 000)過夜，次日孵HRP標(biāo)記Ⅱ抗(1∶1 000)1 h，暗室中加入發(fā)光液，其中PSMA使用超敏ECL發(fā)光液；p-JNK使用ECL發(fā)光液。黑白膠片曝光。

2.2.2細(xì)胞免疫化學(xué) 每組細(xì)胞按照每孔5×104個細(xì)胞接種于24孔板中培養(yǎng)1 d。予無血清RPMI-1640培養(yǎng)基換液孵育24 h，再使用一般培養(yǎng)基及含SP600125的培養(yǎng)基，外環(huán)境處理同Western blotting，多聚甲醛固定后滴入非免疫山羊血清封閉。滴入1∶1 000稀釋兔抗人p-JNK單克隆抗體100 μL；將該24孔板放入自制保濕盒中，4 ℃過夜。次日洗滌后滴入生物素標(biāo)記羊抗兔IgG 1 滴/孔，室溫孵育20 min，洗滌。滴入辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液后，加入DAB液，洗脫后滴入蘇木素Mayor染核。鏡下觀察及統(tǒng)計分析：鏡下觀察各組細(xì)胞的染色情況，每孔隨機(jī)選取5個高倍視野(10×20)。確定細(xì)胞陽/陰性染色較為主觀，因此選取一個較為淺染的細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞，濃于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞為陽性細(xì)胞，淺于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞為陰性細(xì)胞，并對3組細(xì)胞p-JNK的表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析(SPSS 17.0軟件)。

2.3各組細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡的檢測

2.3.1CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖 取各組細(xì)胞，消化分離后分別用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基和加入含25 μmol/L SP600125的上述培養(yǎng)基重懸離心細(xì)胞后，通過細(xì)胞計數(shù)板人工計數(shù)，以2 000 cells/well接種于96孔板，每孔體積100 μL，每組設(shè)3個復(fù)孔，每2 d予相應(yīng)的培養(yǎng)基換液1次(分別使用一般RPMI-1640培養(yǎng)基及含有SP600125的RPMI-1640培養(yǎng)基)。到檢測時點時取出需檢測的培養(yǎng)板，往培養(yǎng)孔中每孔加入CCK-8 試劑10 μL，后培養(yǎng)2 h，在酶標(biāo)儀上測各組細(xì)胞的A450值，分別測24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h和168 h 7個時點，復(fù)孔檢測結(jié)果取均值并繪制生長曲線。

2.3.2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 各組細(xì)胞實驗前分別使用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基及含SP600125的上述培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。消化、重懸后移入流式管，加入2 mL 于-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇，密封后置于4 ℃冰箱過夜。次日送入流式細(xì)胞儀室對各組細(xì)胞S期、G0-G1期、G2-M期的百分比作檢測。

2.3.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將各組細(xì)胞制作細(xì)胞懸液(5×105個細(xì)胞)，具體方法同上，后加入1.25 μL Annexin V-FITC，室溫(18～24 ℃)避光反應(yīng)15 min后離心去上清。0.5 mL預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液輕輕重懸后加入10 μL 溴化丙啶(propidium iodide,PI)，冰上避光保存，流式細(xì)胞術(shù)檢測分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，并采用單因素方差分析或者Kruskal-Wallis檢驗；計數(shù)資料采用Pearson2檢驗。統(tǒng)計分析軟件使用SPSS 17.0。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 JNK/SAPK蛋白磷酸化水平檢測結(jié)果

1.1Western blotting 如圖1所示，在PSMA高表達(dá)時，p-JNK/SAPK高表達(dá)；在PSMA低表達(dá)時，p-JNK/SAPK低表達(dá)，與空白對照組相比，均存在明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。而在加入SP600125的培養(yǎng)基中，各組細(xì)胞中p-JNK/SAPK表達(dá)沒有顯著差異，但較常規(guī)培養(yǎng)組低。

1.2細(xì)胞免疫化學(xué) 圖2為用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法觀察各組細(xì)胞p-JNK/SAPK的表達(dá)情況。對陽/陰性細(xì)胞的計數(shù)和統(tǒng)計表明，在RPMI-1640培養(yǎng)基中，shPSMA組的p-JNK/SAPK表達(dá)明顯低于control組(P<0.05)，而pcDNA-PSMA組的p-JNK/SAPK表達(dá)明顯高于control組(P<0.05)；在含有SP600125的培養(yǎng)基中，3組細(xì)胞p-JNK/SAPK的表達(dá)接近，無明顯差異，見圖2。

Figure 1. The expression of PSMA, JNK and p-JNK in different groups tested by Western blotting.Lane 1: shPSMA+SP600125; Lane 2: pcDNA-PSMA+SP600125; Lane 3: control+SP600125; Lane 4: shPSMA; Lane 5: pcDNA-PSMA; Lane 6: control group. Mean±SD. n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs control group.

2 細(xì)胞增殖、周期、凋亡的檢測結(jié)果

2.1細(xì)胞生長曲線 在RPMI-1640培養(yǎng)基中，shPSMA組的增殖能力明顯較control組低(P<0.05)，而pcDNA-PSMA組較control組高(P<0.05)，并在120 h后有顯著差異；在含有SP600125的培養(yǎng)基中，3組細(xì)胞增殖能力均處于低水平，但在144 h后比在RPMI-1640培養(yǎng)基中的shPSMA組水平更低，見圖3。

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果 在RPMI-1640培養(yǎng)基中，shPSMA組、pcDNA-PSMA組和control組處于S期細(xì)胞的百分比是29.58%、42.36%和36.10%；在含有SP600125的培養(yǎng)基中，shPSMA組、pcDNA-PSMA表達(dá)組和control組處于S期細(xì)胞的百分比是27.51%、29.21%和28.82%。在一般RPMI-1640培養(yǎng)基中，shPSMA組S期細(xì)胞的百分比明顯低于control組，而pcDNA-PSMA組則高于control組；而在含SP600125培養(yǎng)基中，3組處于S期細(xì)胞的百分比均在較低水平，3組間無明顯差異，見圖4。

Figure 2. The expression of p-JNK/SAPK in different groups tested by immunocytochemistry (×400).Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.05 vs control group.

Figure 3. Cell growth curve of each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs control group.

Figure 4. The percentage of cells in S phase detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.05 vs control group.

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果 如圖5所示，常規(guī)培養(yǎng)條件下，shPSMA組、pcDNA-PSMA組和control組中凋亡率分別為9.6%、3.4%和4.7%；在加入SP600125時，各組的凋亡率分別為7.7%、2.1%和3.5%。在shPSMA組中，前列腺癌細(xì)胞的凋亡率明顯高于control組，這與是否加入JNK抑制劑SP600125無關(guān)；而在pcDNA-PSMA表達(dá)組，細(xì)胞凋亡率明顯低于control組；加入JNK抑制劑SP600125后，細(xì)胞凋亡率均低于常規(guī)培養(yǎng)組，但是PSMA對凋亡的調(diào)控趨勢未改變。因此，PSMA可以抑制前列腺癌細(xì)胞的凋亡，JNK通路是其一條重要的通路，但是并不是唯一的通路，應(yīng)該還存在其它的信號通路對細(xì)胞的凋亡進(jìn)行調(diào)控。

Figure 5. Apoptotic rate of each group tested by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs control group.

討 論

PSMA是基因位于染色體11p11～12的橫跨細(xì)胞膜的Ⅱ型糖蛋白[7-8]。它是一種高特異性的前列腺癌瘤標(biāo)，和腫瘤惡性程度相關(guān)。在正常的前列腺細(xì)胞中，PSMA少量表達(dá)于基底細(xì)胞[9]，在前列腺癌細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在轉(zhuǎn)移性的雄激素非依賴性前列腺癌中有更高表達(dá)[10-11]。此外，PSMA在去勢治療后表達(dá)上調(diào)[12]。我們前期的研究也表明PSMA在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中其重要作用，可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖、侵潤能力，抑制凋亡發(fā)生[13]，但是關(guān)于PSMA對前列腺癌細(xì)胞調(diào)控的具體機(jī)制和細(xì)胞信號通路目前還不清楚，因此我們進(jìn)行了后續(xù)的研究。

JNK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)家族重要成員之一，由于它可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)，因此也被稱為應(yīng)激激活蛋白激酶。JNK信號通路能介導(dǎo)多種胞外刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，參與了包括前列腺癌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的凋亡發(fā)生，在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。JNK 位于胞漿，由3 個基因編碼，它們分別是：JNK1、JNK2 和JNK3。JNK1 和JNK2 基因在全身廣泛表達(dá)，而JNK3 則是呈限制性表達(dá)。這3種基因都能編碼產(chǎn)生46 kD和55 kD 的蛋白產(chǎn)物，因為3種基因的不同分布，執(zhí)行的細(xì)胞功能也各有差異[14]。目前認(rèn)為，JNK 促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要有2點：(1)上調(diào)促凋亡蛋白的表達(dá)：JNK 通過使轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1 活性增強(qiáng)進(jìn)一步促進(jìn)p53、Bax、FasL、TNF 等促凋亡蛋白的表達(dá)；(2)作用于線粒體：如Bax、Bak 等促使細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入胞漿，細(xì)胞色素C和caspase-9結(jié)合，最終作用于caspase-3，激活的caspase-3與凋亡底物結(jié)合引起細(xì)胞凋亡。

PSMA是位于前列腺細(xì)胞中的一種跨膜糖蛋白，而JNK是MAPK通路中最重要的信號分子，兩者都與前列腺癌的進(jìn)展相關(guān)。我們早期的研究提示，在前列腺癌細(xì)胞中，抑制PSMA表達(dá)后，前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等均受到影響[13, 15-16]，對于其具體的機(jī)制我們進(jìn)行了初步探討，并證明PSMA可以對p38/MAPK通路進(jìn)行調(diào)控，作為前列腺癌細(xì)胞中對p38通路調(diào)控的一個新的靶點[17]。同時，PSMA還可以對ERK通路進(jìn)行調(diào)控，ERK通路同樣參與了PSMA對前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)影響的過程[18]。那么作為MAPK通路中另一個重要的通路JNK是否也受到PSMA的影響？為了確定PSMA和JNK磷酸化是否存在關(guān)聯(lián)，以及是否對前列腺癌細(xì)胞起作用，我們設(shè)立了抑制PSMA表達(dá)的LNCaP組，增強(qiáng)PSMA表達(dá)組及空白組。3組分別在一般培養(yǎng)基和存在JNK通路抑制劑SP600125的培養(yǎng)基中孵育。通過檢測3組細(xì)胞在2種培養(yǎng)條件下的JNK/SAPK通路及細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡等情況來驗證PSMA對JNK/SAPK通路的調(diào)控及是否通過JNK/SAPK通路對前列腺癌細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生調(diào)控。

與其它2組相比，抑制PSMA蛋白表達(dá)后，p-JNK/SAPK水平下降；增強(qiáng)PSMA表達(dá)后，p-JNK/SAPK水平升高；而在SP600125的作用下，3組JNK磷酸化水平均下降。細(xì)胞免疫組化結(jié)果也證明兩者之間的關(guān)系。這個結(jié)果表明PSMA參與了p-JNK/SAPK通路的激活。此外，我們檢測了3組細(xì)胞在有無JNK抑制劑情況下的增殖、細(xì)胞周期、凋亡情況。通過LNCaP細(xì)胞生長曲線表明，抑制PSMA組的生長增殖能力明顯低于空白對照組，而增強(qiáng)PSMA表達(dá)組則高于空白對照組；但在使用SP600125培養(yǎng)基組中3組生長曲線相近，而且明顯低于一般培養(yǎng)基組。通過流式細(xì)胞術(shù)評估各組細(xì)胞周期變化情況顯示，在常規(guī)培養(yǎng)條件下，抑制PSMA表達(dá)后細(xì)胞S期百分比少于空白對照組；增強(qiáng)PSMA表達(dá)后則高于空白對照組；在SP600125培養(yǎng)基條件下，3組的S期百分比幾乎相同。這個細(xì)胞周期檢測的結(jié)果顯示PSMA通過激活JNK通路來調(diào)控前列腺癌細(xì)胞周期。關(guān)于凋亡的檢測顯示在抑制PSMA表達(dá)組中，前列腺癌細(xì)胞的凋亡率明顯高于增強(qiáng)PSMA表達(dá)組和空白對照組，這與是否加入JNK抑制劑SP600125無關(guān)；而在增強(qiáng)PSMA表達(dá)組，細(xì)胞凋亡率明顯低于空白對照組；加入JNK抑制劑SP600125后，細(xì)胞凋亡率均低于常規(guī)培養(yǎng)組，但是PSMA對凋亡的調(diào)控趨勢未改變。因此，結(jié)合我們前期的研究結(jié)果可以推斷PSMA可以抑制前列腺癌細(xì)胞的凋亡，JNK通路是其中一條重要的通路，但是并不是唯一的通路，應(yīng)該還存在其它的信號通路對細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控，比如ERK、p38、Akt等[19]。而這些通路之間的相互作用關(guān)系還不清楚，我們后期的研究將進(jìn)一步進(jìn)行該方面的深入研究，以闡明PSMA下游的信號通路網(wǎng)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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