王曉麗， 董妙先， 徐天嬌， 李成沖， 孫輯凱， 李曉明△

(1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117)

缺血性腦病是一種由腦短暫性血液供應(yīng)不足引起的常見急性腦血管病。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后大部分血管能自然再通或經(jīng)溶栓治療恢復(fù)再通，但同時(shí)也會(huì)造成進(jìn)一步腦損傷和功能障礙，即腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)[1]。神經(jīng)元活性降低甚至凋亡是腦缺血再灌注損傷后出現(xiàn)的最重要的形式[2]。因此，找到能夠降低或抑制海馬神經(jīng)元缺糖缺氧再灌損傷的藥物就成為目前治療缺血性腦病的迫切需要。中藥石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott)在具有開竅豁痰、醒神益智的功效，其主要活性成分為β-細(xì)辛醚。β-細(xì)辛醚能通過血腦屏障，腦組織是其主要分布器官。我們前期研究結(jié)果顯示，β-細(xì)辛醚對(duì)β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡具有抑制作用[3-4]，其機(jī)制可能與細(xì)胞線粒體信號(hào)通路有關(guān)。體內(nèi)研究也佐證了β-細(xì)辛醚對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡有一定保護(hù)作用[5-6]，但對(duì)缺糖缺氧再灌注引起的神經(jīng)元損傷是否具有保護(hù)作用尚不清楚，因此，本研究將在體外探討β-細(xì)辛醚對(duì)缺糖缺氧再灌注損傷后大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1動(dòng)物 SD健康大鼠，體重(200±10)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK(京)2007-0001。經(jīng)雌雄合籠獲得子代新生大鼠。

1.2儀器 ABI 7300 熒光定量 PCR 儀(ABI)；UV-2550 型紫外分光光度計(jì)(島津)；2700 型 PCR System 擴(kuò)增儀(Applied Biosystems)；JY-ZY2型轉(zhuǎn)移電泳槽和JY-CZ1型單垂直電泳槽(北京君意東方)；SmartChemi II一體式化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(北京賽智)；Countess C10227細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Invitrogen)。

1.3藥品及試劑 β-細(xì)辛醚(天津一方科技)； JNK1/2抗體(Sigma)； p-JNK1/2抗體(Promega)； Bcl-2抗體(Chemicon)；BCA蛋白定量試劑盒(上海申能博彩)； TRIzol Reagent(Gibco-BRL)；Bcl-2和caspase-3引物(上海生工合成)；caspase-3活性分光光度法檢測(cè)試劑盒(南京碧波)。

2 方法

2.1海馬神經(jīng)元的提取及培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)報(bào)道[7]的方法并做少許改良，取24 h內(nèi)新生大鼠，75%乙醇溶液消毒，無菌臺(tái)內(nèi)取海馬組織剪碎，0.125%胰蛋白酶消化15 min，用含15% FBS的DMEM終止消化，1 000 r/min離心5 min，將沉淀組織重復(fù)消化離心2次，再用DMEM制成細(xì)胞懸液，200目過濾。以5×108cells/L密度接種于培養(yǎng)皿中，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2海馬神經(jīng)元缺糖缺氧再灌注損傷及藥物處理 將原代培養(yǎng)8 d的海馬神經(jīng)元分為空白對(duì)照組、損傷組、損傷+不同濃度的β-細(xì)辛醚組和損傷+β-細(xì)辛醚+SP600125共處理組，共5組。除空白對(duì)照組正常更換液培養(yǎng)海馬神經(jīng)元外，其余各組均加入無糖Hanks液并放入缺氧盒內(nèi)，持續(xù)緩慢通入含有N2的混合氣體2 h，取出并吸棄平衡鹽緩沖液，換以完全培養(yǎng)基置入CO2培養(yǎng)箱孵育。其中損傷+藥物處理組于指定再灌注時(shí)點(diǎn)前加入不同濃度(3.6×10-5mol/L、7.2×10-5mol/L、14.4×10-5mol/L、28.8×10-5mol/L和57.6×10-5mol/L)β-細(xì)辛醚，而損傷+β-細(xì)辛醚+SP600125組于再灌注前分別加入β-細(xì)辛醚和JNK特異性抑制劑SP600125共處理。

2.3海馬神經(jīng)元存活率檢測(cè) 取出種植各組細(xì)胞的培養(yǎng)皿，加入MTT溶液，37 ℃孵育4 h，加DMSO溶液，待藍(lán)色顆粒溶解，酶標(biāo)儀490 nm測(cè)定吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率(以正常對(duì)照組存活率為100%作為基準(zhǔn))。β-細(xì)辛醚處理濃度及處理時(shí)間根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3]進(jìn)行設(shè)置。

2.4海馬神經(jīng)元caspase-3活性檢測(cè) 海馬神經(jīng)元caspase-3活性檢測(cè)按照caspase-3活性檢測(cè)按試劑盒說明書操作。結(jié)果以正常對(duì)照組的百分比表示。

2.5海馬神經(jīng)元JNK、p-JNK和Bcl-2蛋白表達(dá)檢測(cè) 收集細(xì)胞，BCA法測(cè)定蛋白含量，取60 μg樣品，加入0.25倍蛋白質(zhì)體積的上樣緩沖液，SDS-PAGE法進(jìn)行蛋白分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜。與抗p-JNK、JNK、Bcl-2和GAPDH等多克隆抗體25 ℃孵育4 h，生物素標(biāo)記的Ⅱ抗孵育2 h。加入Western blotting熒光檢測(cè)試劑激發(fā)熒光，一體式化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)掃描、分析各蛋白質(zhì)條帶的積分吸光度。

2.6海馬神經(jīng)元Bcl-2和caspase-3 mRNA表達(dá)檢測(cè) 收集細(xì)胞，用TRIzol試劑提取RNA，按ExscriptTMRT reagent kit說明書操作，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照PCR Amplification kit說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列如下：Bcl-2 正義鏈5’-TGA ACC GGC ATC TGC ACA C-3’，反義鏈5’-CGT CTT CAG AGA CAG CCA GGA G-3’；caspase-3 正義鏈5’-GCA GCA GCC TCA AAT TGT TGA CTA-3’，反義鏈5’-TGC TCC GGC TCA AAC CAT C-3’；GAPDH 正義鏈5’-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3’，反義鏈5’-AAT GTC ACG CAC GAT TTC CC-3’。數(shù)據(jù)分析用2-ΔΔCt法。其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參照基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參照基因)對(duì)照組。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mesn±SD)表示，用SPSS 13.0軟件分析。多組間差異的顯著性分析采用方差分析，組間兩兩比較用SNK檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 β-細(xì)辛醚對(duì)原代海馬神經(jīng)元活力的影響

經(jīng)缺糖缺氧2 h與再灌注損傷后，培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元在0～48 h內(nèi)與正常對(duì)照組比較，損傷組細(xì)胞活力明顯下降(P<0.05)。而加入不同劑量β-細(xì)辛醚處理后，與損傷組相比，海馬神經(jīng)元活力明顯升高(P<0.05)，并在6～24 h內(nèi)呈時(shí)效依賴關(guān)系，表明β-細(xì)辛醚對(duì)原代海馬神經(jīng)元缺糖缺氧再灌造成的損傷具有一定抑制作用，見表1。

表1 β-細(xì)辛醚對(duì)海馬神經(jīng)元活力的影響

2 分光光度法檢測(cè)海馬神經(jīng)元caspase-3活性

與正常對(duì)照組比較，損傷組細(xì)胞caspase-3活性顯著升高(P<0.05)。與損傷組相比，不同劑量β-細(xì)辛醚處理組海馬神經(jīng)元caspase-3活性顯著降低(P<0.05)。表明β-細(xì)辛醚對(duì)原代海馬神經(jīng)元缺糖缺氧再灌造成的損傷具有一定抑制作用，見表2。

表2 β-細(xì)辛醚對(duì)海馬神經(jīng)元caspases-3活性及Bcl-2、caspases-3 mRNA表達(dá)的影響

3 β-細(xì)辛醚對(duì)原代海馬神經(jīng)元p-JNK和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，損傷組海馬神經(jīng)元JNK磷酸化較正常對(duì)照組顯著增加，Bcl-2的蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組顯著下調(diào)(P<0.05)。與損傷組相比，損傷+β-細(xì)辛醚組海馬神經(jīng)元JNK磷酸化顯著增加，Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。而SP600125抑制了β-細(xì)辛醚對(duì)JNK磷酸化和Bcl-2蛋白表達(dá)的調(diào)控作用，見圖1。

在6～24 h內(nèi)，海馬神經(jīng)元JNK磷酸化明顯減少，Bcl-2的蛋白表達(dá)逐漸上調(diào)，呈時(shí)間依賴性，見圖2。

4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)海馬神經(jīng)元Bcl-2和caspase-3 mRNA表達(dá)

如表2所示，與正常對(duì)照組比較，損傷組Bcl-2 mRNA 的表達(dá)均明顯下調(diào)，caspase-3 mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)。與損傷組比較，損傷+β-細(xì)辛醚組Bcl-2 mRNA 的表達(dá)明顯上調(diào)，caspase-3 mRNA 的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。而SP600125抑制了β-細(xì)辛醚的上述作用。

討 論

缺血性腦病，中醫(yī)上屬“中風(fēng)”、“卒中”等范疇，其病因病機(jī)主要有以下5種：風(fēng)、痰、瘀、火、虛。目前臨床上用于治療腦缺血的中藥多以開竅醒腦、益氣活血、疏風(fēng)通絡(luò)等為主。中藥石菖蒲屬芳香開竅藥，其氣味芳香，善于走竄,以開竅醒神為主要功效。其主要活性成分為β-細(xì)辛醚。吳宏斌等[8]對(duì)石菖蒲的有效部位進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，石菖蒲揮發(fā)油中β-細(xì)辛醚醒腦開竅作用最好，且極易透過血腦屏障進(jìn)人大腦。本研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量β-細(xì)辛醚處理后，海馬神經(jīng)元活力明顯升高，并在6～24 h內(nèi)呈時(shí)效依賴關(guān)系。利用分光光度法檢測(cè)海馬神經(jīng)元caspase-3活性，經(jīng)不同劑量β-細(xì)辛醚處理后，海馬神經(jīng)元caspase-3活性明顯降低。與方永奇等[9]利用原位末端標(biāo)記法觀察得到β-細(xì)辛醚能夠改善腦水腫，提高耐缺氧能力，抑制大鼠腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的結(jié)果相一致。陳奕芝等[10]通過形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞活力檢測(cè)研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的β-細(xì)辛醚對(duì)PC12細(xì)胞和皮層神經(jīng)細(xì)胞有促增殖作用。均說明β-細(xì)辛醚對(duì)輕度腦缺血再灌注后神經(jīng)元可能具有保護(hù)作用。

Figure 1. The effects of β-asarone on the protein expression of p-JNK and Bcl-2 in hippocampal neurons.Mean±SD.n=5. A: normal control group; B: model group; C: model +β-asarone (7.2×10-5 mol/L) group; D: model +β-asarone (14.4×10-5 mol/L) group; E: model +β-asarone (14.4×10-5 mol/L) + SP600125 group. *P<0.05 vs B.

Figure 2. The effects of β-asarone (14.4×10-5 mol/L ) on the protein expression of p-JNK and Bcl-2 in the hippocampal neurons (0 h～48 h). Mean±SD.n=5.*P<0.05 vs 0 h.

線粒體被稱為內(nèi)源性凋亡發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，它可以為機(jī)體提供直接利用的能量[11]。在海馬神經(jīng)元缺糖缺氧再灌損傷發(fā)生時(shí)，線粒體首先受到影響，若損傷不能及時(shí)解除，即可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元發(fā)生凋亡。JNK信號(hào)通路在細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡以及應(yīng)激反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[12]。JNK信號(hào)通路屬于絲裂原激活蛋白激酶通路之一。研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血損傷過程中尤其是程序性細(xì)胞死亡過程中起著重要的調(diào)控作用[13]。Bcl-2家族是JNK的下游核內(nèi)底物之一，通過Bcl-2家族蛋白，活化(即磷酸化)的JNK可以調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)而激發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等生物學(xué)效應(yīng)[14]。Bcl-2家族蛋白在JNK信號(hào)通路和線粒體途徑的細(xì)胞凋亡之間發(fā)揮橋梁的作用。

我們研究發(fā)現(xiàn)，β-細(xì)辛醚處理抑制了原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中JNK的磷酸化，進(jìn)而上調(diào)了下游Bcl-2的蛋白表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)了caspase-3的表達(dá)，從而發(fā)揮了抗原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元凋亡的作用。我們的結(jié)果也顯示，JNK特異性抑制劑SP600125與β-細(xì)辛醚共處理抑制了β-細(xì)辛醚對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)的調(diào)控作用，表明JNK是Bcl-2蛋白的上游調(diào)控分子，同時(shí)也驗(yàn)證了JNK信號(hào)通路涉及β-細(xì)辛醚對(duì)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元缺糖缺氧再灌損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。

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