IL-33基因單核苷酸多態(tài)性與中國(guó)南方漢人炎癥性腸病臨床表型相關(guān)*

張青森， 楊慶帆， 陳白莉， 何 瑤， 陳旻湖， 曾志榮

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科, 廣東 廣州 510080)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種病因尚不清楚的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn disease，CD)。近年來(lái)，炎癥性腸病的發(fā)病率明顯上升[1-2]。然而，其發(fā)病機(jī)制仍未明確，目前認(rèn)為是由遺傳、環(huán)境和免疫等多因素共同作用所致。

白細(xì)胞介素33(interleukin-33，IL-33)是新近發(fā)現(xiàn)的炎癥因子，具有抑制和促進(jìn)炎癥的雙重作用[3-4]，與多種免疫及過(guò)敏性疾病相關(guān)[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，其在IBD患者腸、黏膜和血清中明顯異常表達(dá)[7-8]，并在IBD炎癥、黏膜愈合及纖維化等方面發(fā)揮重要作用[9]。Latiano等[10]近期發(fā)現(xiàn)IL-33基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP) rs3939286增加意大利人IBD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而關(guān)于IL-33基因多態(tài)性與中國(guó)人群IBD的關(guān)系尚無(wú)報(bào)道，本研究旨在探討IL-33基因單核苷酸多態(tài)性與中國(guó)南方人群IBD發(fā)病及臨床表型間關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 研究對(duì)象

將我院 2003年～2012年IBD診治中心確診的365例IBD患者 (CD 250例，UC 115例)，以及同期在我院健康體檢的622名性別、年齡匹配的健康人(無(wú)免疫系統(tǒng)相關(guān)病史)納入本研究。IBD診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2012年中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)推薦標(biāo)準(zhǔn)[11]，基于臨床表現(xiàn)、消化內(nèi)鏡及組織學(xué)檢查作出臨床診斷，確診病例為經(jīng)病情觀察符合CD/UC病程經(jīng)過(guò)或通過(guò)手術(shù)取得病理診斷者。臨床資料通過(guò)查閱我中心IBD數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，包括患者人口學(xué)資料及臨床分型特征，即性別、發(fā)病年齡、癥狀、吸煙史、家族史、腸外表現(xiàn)、肛周病變、臨床特征等，IBD臨床分型采用蒙特利爾分型標(biāo)準(zhǔn)[12]，見(jiàn)表1。本研究已通過(guò)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，標(biāo)本采集獲得研究對(duì)象的知情同意。

表1 炎癥性腸病病人基本資料

2 方法

2.1基因組DNA獲取 采集患者及健康對(duì)照每人2 mL外周血，利用天根血液基因組織DNA 提取試劑盒 (北京天根有限公司) 提取基因組DNA。操作步驟參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

2.2SNP挑選及分型檢測(cè) 本研究選擇的8個(gè)標(biāo)簽SNP(Tag-SNP)是綜合考慮已有文獻(xiàn)對(duì)于IL-33與疾病關(guān)系的報(bào)道以及SNP位點(diǎn)在IL-33基因的具體位置而確定的，前者基于IBD與多種免疫相關(guān)疾病存在基因重疊，后者基于突變點(diǎn)是否可能影響IL-33的表達(dá)及功能(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?chooseRs=doublehit&locusId=90865&mrna=NM_001199640.1&ctg=NT_008413.18&prot=NP_001186569.1&orien=forward&refresh=refresh)。各位點(diǎn)的功能特性、最小等位基因頻率及與疾病的關(guān)系情況見(jiàn)表2。SNP檢測(cè)采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)，由深圳華大基因有限公司完成。

表2 8個(gè)SNP的基本信息

2.3相關(guān)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) 內(nèi)鏡下黏膜愈合情況依據(jù)CDEIS評(píng)分分為愈合、部分愈合和未愈合3個(gè)等級(jí)；愈合定義為CDEIS評(píng)分<3分和(或)內(nèi)鏡下未見(jiàn)潰瘍；部分愈合定義為CDEIS評(píng)分3～6分和(或)內(nèi)鏡下腸道黏膜輕度炎癥、小糜爛、淺潰瘍或者潰瘍較前好轉(zhuǎn)；無(wú)效定義為CDEIS評(píng)分較前下降<5分，潰瘍?nèi)匀淮嬖冢^前無(wú)明顯消失或者變淺[11,13]。英夫利昔單抗臨床療效評(píng)估依據(jù)CDAI[11]，臨床有效定義為CDAI下降≥70分，臨床緩解定義為CDAI下降雖<70分但CDAI<150分，臨床無(wú)效為使用英夫利昔單抗治療10周時(shí)患者臨床癥狀未改善且CDAI評(píng)分>150分。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。根據(jù)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，采用2檢驗(yàn)分析CD、UC及對(duì)照組樣本的群體代表性。各SNP位點(diǎn)在病例組與對(duì)照組基因型及等位基因分布頻率的比較采用 Pearson2檢驗(yàn)；基因型及等位基因與IBD臨床特征間關(guān)系采用單因素和Logistic回歸分析，計(jì)算優(yōu)勢(shì)比(odds ratio，OR)及其95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)，其中OR值經(jīng)性別和年齡校正。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 一般情況

本研究病例組共納入365例IBD患者，均為中國(guó)南方漢族人(表1)，其中CD 250例，UC 115例。CD患者平均年齡(32.7±12.3)歲，其中男性160(64.0%)例；UC患者平均年齡(38.0±13.6)歲，男性共68(87.0%)例。對(duì)照組共622名，平均年齡(31.4±8.0)歲，男性400(64.3%)例。CD及UC組與對(duì)照組間的性別和年齡構(gòu)成比均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2 IL-33各SNPs基因型在IBD患者及健康人群中的分布

挑選的8個(gè)SNP在CD、UC及對(duì)照組中基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，具有群體代表性。進(jìn)一步分析比較發(fā)現(xiàn)，這8個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率在病例及對(duì)照組中均無(wú)顯著差異(P>0.05),見(jiàn)表3。

表3 各SNP的基因型在CD、UC及對(duì)照組中頻數(shù)及頻率分布情況

3 IL-33各SNPs基因型與IBD臨床表型的關(guān)系

rs10118795和rs7025417的基因型與CD患者腸外表現(xiàn)相關(guān)。rs10118795 含等位基因T的基因型(包括CT和TT)是腸外表現(xiàn)的保護(hù)因素(P<0.05, OR=0.513, 95% CI： 0.281～0.938)，見(jiàn)表4；而rs7025417 CC基因型的CD患者出現(xiàn)腸外表現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)更高(P<0.05, OR=1.363, 95% CI： 1.006～1.846),見(jiàn)表5。

表4 rs10118795基因型與CD臨床特征的相關(guān)性

表5 rs7025417基因型與CD臨床特征的相關(guān)性

rs10118795及 rs10975519與CD患者肛周病變相關(guān)，而rs10975509跟CD患者初診時(shí)病變部位相關(guān)。rs10118795 含C等位基因的基因型(CC和CT)降低肛周病變風(fēng)險(xiǎn)(P<0.05, OR=0.480, 95% CI： 0.232～0.994),見(jiàn)表4；而rs10975519野生純和子CC顯著增加肛周病變風(fēng)險(xiǎn)(P<0.05, OR=2.054，95% CI： 1.053～4.009),見(jiàn)表6。對(duì)于rs10975509，其與上消化道型CD高度相關(guān)，含G等位基因的基因型(GA和GG)增加上消化道型CD風(fēng)險(xiǎn)(P<0.05, OR=3.570, 95% CI： 1.328～9.600)，同時(shí)該SNP 的A等位基因是回結(jié)腸型CD(P<0.05, OR=0.613, 95% CI： 0.377～0.996)的保護(hù)因素,見(jiàn)表7。

表6 rs10975519基因型與CD臨床特征的相關(guān)性

表7 rs10975509基因型與CD臨床特征的相關(guān)性

在SNP與英夫利昔單抗治療療效關(guān)系分析中，共納入29名長(zhǎng)期行英夫利昔單抗治療CD患者，我們分析了8個(gè)SNP位點(diǎn)基因型與10周、30周內(nèi)鏡黏膜愈合情況及臨床療效的關(guān)系。rs10118795、rs10975509和rs7025417基因型與英夫利昔單抗治療后CD患者30周黏膜愈合相關(guān)(分別為P<0.05、P<0.01和P<0.05),見(jiàn)表8，但進(jìn)一步分析未能明確某一個(gè)基因是30周黏膜愈合的危險(xiǎn)或者保護(hù)因素。8個(gè)SNP與英夫利昔單抗治療臨床療效無(wú)關(guān)。

表8 SNP與CD患者英夫利昔單抗治療30周黏膜愈合情況的相關(guān)性

同時(shí)，對(duì)這8個(gè)SNPs與UC發(fā)病及臨床表型的關(guān)系的分析未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性(P>0.05)。

討 論

IBD作為一種發(fā)病率逐年增加的腸道非特異性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，研究表明遺傳、免疫、環(huán)境等多種因素參與到IBD發(fā)病中。在遺傳方面， IBD國(guó)際基因協(xié)作組通過(guò)GWAs及基因芯片技術(shù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有關(guān)IBD的163個(gè)基因位點(diǎn)[14]，盡管如此，仍有約30%常見(jiàn)變異型未被包括在內(nèi)。許多研究顯示，炎癥因子及其受體基因的SNP與IBD疾病易感性相關(guān)，例如很多IL-1家族成員，如IL-1β[15]、IL-1RA[16]、IL-18等[17]，它們的基因SNPs均與IBD疾病易感性相關(guān)。IL-33是IL-1家族的新成員。研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)炎癥具有雙向調(diào)節(jié)作用：一方面，可進(jìn)入核內(nèi)抑制基因轉(zhuǎn)錄[3]，最終抑制炎癥信號(hào)通路；另一方面，可通過(guò)與跨膜ST2(ST2L，需IL-1RAcP輔助)[4]作用激活炎癥通路，從而促進(jìn)腸道炎癥；此外，IL-33還可促進(jìn)IBD炎癥慢性轉(zhuǎn)化并參與腸黏膜愈合、上皮修復(fù)及纖維化過(guò)程[18]。

本研究選擇了IL-33基因的8個(gè)SNP位點(diǎn)，研究其與中國(guó)南方漢人IBD間的關(guān)系。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，這8個(gè)SNP位點(diǎn)并不增加IBD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但我們發(fā)現(xiàn)rs10118795、rs7025417、rs10975509和rs10975519影響CD的臨床表型。

rs10118795、rs7025417和rs10975509均位于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(transcription factor binding site，TFBS)，TFBS是與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA序列，它們與轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，因此這些位點(diǎn)的變異可能影響IL-33的表達(dá)，從而影響疾病表型。我們研究首次發(fā)現(xiàn)這3個(gè)SNP位點(diǎn)與CD相關(guān)。rs10118795 T等位基因是腸外表現(xiàn)的保護(hù)因素，且C等位基因攜帶者出現(xiàn)肛周病變的風(fēng)險(xiǎn)降低；而在rs7025417，攜帶基因型CC的CD患者出現(xiàn)腸外表現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)更高；rs10975509則與CD病變部位相關(guān)，AA基因型的患者出現(xiàn)上消化道型CD風(fēng)險(xiǎn)更高，同時(shí)數(shù)據(jù)顯示該SNP GG基因型增加出現(xiàn)回結(jié)腸型CD的風(fēng)險(xiǎn)。最后，我們還發(fā)現(xiàn)這3個(gè)SNP的基因型與英夫利昔單抗治療后CD患者30周黏膜愈合相關(guān)，但進(jìn)一步分析未發(fā)現(xiàn)哪一個(gè)基因是30周黏膜愈合的危險(xiǎn)或者保護(hù)因素，可能是樣本量不足所致。

rs10975519和rs1929992在日本人花粉癥中有報(bào)道[19]，前者與花粉癥發(fā)病無(wú)關(guān)，而后者CC型基因增加該病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本研究并未發(fā)現(xiàn)rs1929992與中國(guó)IBD發(fā)病及臨床表型相關(guān)，但rs10975519 CC型增加CD患者出現(xiàn)肛周病變機(jī)會(huì)，據(jù)報(bào)道[19]rs10975519位于IL-33基因外顯子區(qū)域，可出現(xiàn)錯(cuò)意突變，并與周?chē)鷫A基形成剪切增強(qiáng)子或剪切沉默子，由此可能影響IL-33的表達(dá)水平或者mRNA穩(wěn)定性。

rs11792633和rs7044343均為內(nèi)含子，前者與漢人及白種人阿爾茲海默病發(fā)病相關(guān)，其T等位基因?yàn)樵摷膊〉谋Ｗo(hù)性因素，而后者只與白種人阿爾茲海默病發(fā)病相關(guān)[20]，但本研究未發(fā)現(xiàn)它們?cè)贗BD中的作用。

由于這8個(gè)SNP位點(diǎn)存在高度連鎖不平衡，所以未進(jìn)一步做單體型分析。另外，本研究中納入進(jìn)行IL-33 SNP與英夫利昔單抗治療療效關(guān)系分析的樣本數(shù)目過(guò)少，因此，它們之間的具體關(guān)系有待繼續(xù)論證。

IBD的遺傳背景十分復(fù)雜，作為一種多基因疾病，不同的人種、國(guó)家甚至地區(qū)間均存在遺傳易感性差異，本研究分析了IL-33與中國(guó)南方漢人IBD遺傳易感性的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)了與中國(guó)南方人群相關(guān)的tSNPs，其中rs7025417跟CD臨床表型相關(guān)，然而Latiano等[10]研究表明，rs7025417跟意大利IBD的發(fā)病及臨床表型均無(wú)關(guān)，這進(jìn)一步說(shuō)明不同種族存在著遺傳易感性差異；此外，IL-33與其他人群的關(guān)系有待進(jìn)一步研究，以便全面認(rèn)識(shí)IL-33與IBD的關(guān)系。IL-33基因多態(tài)性與其表達(dá)是否相關(guān)，其多態(tài)性參與調(diào)節(jié)IBD疾病進(jìn)展的具體機(jī)制仍有待研究。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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