pEGFP-HSP70重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在大鼠神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá)*

舒曉明, 逯 丹, 王 珍, 張嬋娟, 趙佳儀, 朱麗紅, 戚仁斌, 陸大祥

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632)

隨著蛋白質(zhì)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)更多疾病的真正原因與蛋白質(zhì)異常折疊有關(guān)，如阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)、帕金森病(Parkinson disease, PD)、亨廷頓舞蹈癥(Huntington disease, HD)、牛海綿狀腦病(bovine spongiform encephalopathy，BSE)、家族性高膽固醇血癥、某些腫瘤等稱之為“蛋白折疊病”[1]。而分子伴侶在蛋白質(zhì)的折疊中起至關(guān)重要的作用，熱休克蛋白70(heat-shock protein 70, HSP70)與多肽之間的可逆作用在蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、錯誤折疊多肽的降解及其調(diào)控過程中有著重要的作用[2-3]。

現(xiàn)今對神經(jīng)退行性疾病的治療還停留在對癥治療階段，仍不能對該類疾病進(jìn)行根本性的治療。而基因治療極有可能為該類疾病的治療帶來根本性的突破，在其治療中合理選擇基因靶細(xì)胞又是基因治療成敗的關(guān)鍵因素。由于神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)具備以下特點(diǎn)：能自我維持更新的能力，足以提供大量細(xì)胞；具有多向分化潛能，可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞；有一定遷移能力，能到達(dá)損傷或疾病部位并產(chǎn)生新的細(xì)胞。因其來源于胎腦神經(jīng)組織,與宿主腦組織能很好整合,能在腦內(nèi)增殖和分化[4-5]且有較低的免疫源性而被廣泛地作為神經(jīng)系統(tǒng)基因治療的理想載體，這樣能從根本上解決退行性疾病的功能神經(jīng)元變性和數(shù)量的減少。攜帶了HSP70基因的神經(jīng)干細(xì)胞能夠從多靶點(diǎn)、多途徑上有效地干預(yù)神經(jīng)退行性疾病，是較為理想的治療方法。

材 料 和 方 法

1 材料

大腸桿菌JM109、pMD19-T Simple平滑載體及質(zhì)粒pEGFP-C2為TaKaRa產(chǎn)品。TRIzol試劑、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、cDNA合成試劑盒、TaqDNA聚合酶、X-Gal和IPTG為TaKaRa產(chǎn)品。表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)購自PeproTech。胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞傳至第4代。Nucleofector device 及轉(zhuǎn)染試劑(Lonza)。 DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基和單克隆鼠抗nestin (Millipore)。異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠Ⅱ抗和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)購自上海生物工程公司。Olympus IX51型熒光倒置相差顯微鏡。

2 方法

2.1質(zhì)粒pEGFP-HSP70的構(gòu)建

2.1.1引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank報(bào)道的大鼠HSP70的全長cDNA序列(L16764.1),經(jīng)Primer Premier 5.0分析,設(shè)計(jì)2個(gè)引物: 正義引物5’-CGGAATTCGATGGCCAAGAAAACAGCGATCG-3’，反義引物5’-CGCGGATCCGCGTAATCCACCTCCTCGATGG-3’。正義引物為HSP70全長cDNA 5’端的序列,引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn),含啟始密碼子ATG。反義引物為HSP70全長cDNA 3’端序列的互補(bǔ)序列,引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)。

2.1.2總RNA的提取 取約100 mg新鮮SD大鼠胎肝組織,按步驟提取總RNA。凝膠電泳及A260/A280值明顯提示所抽提的RNA是符合實(shí)驗(yàn)要求的。

2.1.3HSP70 cDNA的合成與PCR擴(kuò)增測序 以Total RNA為模板,使用TaKaRa RNA LA PCR Kit(AMV) Ver.1.1進(jìn)行RT反應(yīng),合成cDNA。再以合成的cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。按常規(guī)的PCR反應(yīng)條件,取2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,先將樣品于95 ℃變性5 min,加入2 UTaqDNA聚合酶,按下列參數(shù)循環(huán)30次:95 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,最后一個(gè)循環(huán)72 ℃ 10 min。若擴(kuò)增片段量少,可進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增反應(yīng)。并切膠回收目的片段,溶于15 μL ddH2O。使用DNA連接試劑將Insert DNA與pMD19-T Simple平滑載體連接后,熱轉(zhuǎn)化至E.coliCompetent JM109 細(xì)胞中,涂布平板后,37 ℃過夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落，提取陽性克隆并命名后進(jìn)行測序。測序后編號為ZL-8標(biāo)本符合要求。

2.2HSP70 cDNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建 質(zhì)粒pEGFP-C2及ZL-8用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切,切膠回收DNA片段。將載體和Insert片段連接,構(gòu)建在體轉(zhuǎn)基因重組質(zhì)粒pEGFP-HSP70, 熱轉(zhuǎn)化至E.coliCompetent DH5α中,涂布平板過夜培養(yǎng)。挑選菌落,提取質(zhì)粒后,再行雙酶切檢測,確認(rèn)目的片段是否插入，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

2.3神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取孕15 d的SD胎鼠，分離腦海馬組織，進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)[6]。培養(yǎng)基采用DMEM/F12、EGF 20 μg/L、bFGF 20 μg/L和2%B27，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng),第1次換液在4～5 d后，以后按2 d換液1次。選取傳代4次的NSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[7]。轉(zhuǎn)染采用Nucleofector device 及轉(zhuǎn)染試劑，程序采用A-33。轉(zhuǎn)染后24 h開始進(jìn)行熒光顯微鏡觀察, 培養(yǎng)克隆擴(kuò)增陽性的熒光細(xì)胞, 采用Image-Pro Plus 6.0 軟件對陽性的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

2.4神經(jīng)干細(xì)胞鑒定 采用免疫組化方法：培養(yǎng)在載玻片上的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定 30 min，在通風(fēng)柜里晾干，0.01 mol/L PBS 漂洗 5 min×3 次，0.5% Triton X-100+10%山羊血清封閉30 min；加入Ⅰ抗小鼠抗大鼠nestin(1∶100)，轉(zhuǎn)入 4 ℃過夜；0.01 mol/L PBS 漂洗 5 min×3 次；加入 FITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠Ⅱ抗(1∶100)，37 ℃、2 h避光；0.01 mol/L PBS 漂洗 5min×3 次；0.5% DAPI染色避光，1 h、0.01 mol/L PBS 漂洗 5 min×3 次，晾干，中性樹脂封片。

2.5Western blotting檢測及熒光觀察 收集神經(jīng)干細(xì)胞，抽提蛋白并測定蛋白濃度，加入等體積的上樣緩沖液煮沸5 min待用。配制5%濃縮膠和10%分離膠，上樣后電泳，用 60 mV電壓使樣品跑至分離膠后，用90 mV電壓電泳至溴酚藍(lán)距離底線0.5 cm左右。 電泳后取出硝酸纖維素膜及濾紙，按次序疊放在電轉(zhuǎn)槽中，根據(jù)目的蛋白的分子量決定電轉(zhuǎn)時(shí)間。牛奶封閉后加Ⅰ抗、Ⅱ抗稀釋液，振搖孵育，用現(xiàn)配制的顯色液避光顯色。圖像處理軟件進(jìn)行蛋白灰度分析。

使用Olympus IX51型熒光倒置相差顯微鏡進(jìn)行熒光觀察,觀察轉(zhuǎn)染后的神經(jīng)干細(xì)胞中綠色熒光的表達(dá),用488 nm波長紫外光激發(fā),發(fā)射光波長為507 nm,選取 24 h、7 d、14 d及21 d熒光強(qiáng)度并使用 Image-Pro Plus 6.0軟件分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。采用 SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠HSP70 cDNA的克隆

我們以TRIzol試劑來提取大鼠胎肝組織的總RNA,A260/A280為2.0, 凝膠電泳分析可見28S及18S兩條RNA條帶，說明抽提的總RNA符合實(shí)驗(yàn)要求。以上述合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到1條約1 926 bp的清晰條帶;使用DNA連接試劑將Insert DNA與pMD19-T Simple平滑載體連接后,熱轉(zhuǎn)化至E.coliCompetent JM109 細(xì)胞中,涂布平板后,37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果提示質(zhì)粒ZL-8的序列與文獻(xiàn)報(bào)道的序列一致。

2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

真核表達(dá)載體pEGFP-C2是一個(gè)帶有突變綠色熒光蛋白的cDNA報(bào)告基因 ,在熒光顯微鏡下能夠檢測到該載體的表達(dá)。將克隆在pMD19-T Simple平滑載體中的大鼠HSP70基因片段以EcoRⅠ及BamHⅠ雙酶切,經(jīng)凝膠電泳分離；再與真核表達(dá)載體pEGFP-C2經(jīng)雙酶切及連接酶作用后構(gòu)建成重組pEGFP-HSP70，見圖1、2。

Figure 1. Construction of recombinant plasmid pEGFP-C2/HSP70.

3 神經(jīng)干細(xì)胞提取及鑒定

從SD大鼠的胎鼠海馬組織提取原代神經(jīng)細(xì)胞干細(xì)胞。加入無血清的干細(xì)胞培養(yǎng)液，傳至第4代用nestin抗體進(jìn)行鑒定分析，鑒定后確認(rèn)為神經(jīng)干細(xì)胞，見圖3。

4 神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及表達(dá)

構(gòu)建好的pEGFP-HSP70轉(zhuǎn)染細(xì)胞后12 h就有熒光表達(dá), 24 h熒光進(jìn)一步增強(qiáng) ,且一定時(shí)間內(nèi)綠色熒光蛋白表達(dá)增多、亮度增強(qiáng)，2周之后熒光強(qiáng)度明顯降低；HSP70的表達(dá)在14 d升高到最高后也逐漸降低，見圖4～6。

Figure 2. Identification of PCR product (A) and recombinant pEGFP-C2/HSP70 plasmid (B) by enzyme digestion.M1: DL2000 DNA marker: M2:λ-Hind Ⅲ digest; 1: PCR product; 2: positive control; 3: negative control; 4: pEGFP-C2 digested by EcoR I and BamH I; 5: pEGFP-C2/HSP70 digested by EcoR I and BamH I; 6: pMD19-T/HSP70 digested by EcoR I and BamH I.

Figure 3. Identification of neural stem cells. Neurospheres were stained with nestin.Abundant fluorescent neurospheres were present. Scale bars: 20 μm.

Figure 4. Comparison of fluorescence intensity of each group 24 h after transfection (×100).Mean±SEM．n=6.**P<0.01 vs control.

討 論

當(dāng)前隨著世界人口的老齡化，神經(jīng)退行性疾病人數(shù)急劇上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)2013年美國有520萬人患有AD，100萬人患有PD[8]。今年估計(jì)45萬美國人會死于AD。AD已成為心腦血管疾病及腫瘤之后又一大致死病因。這給家庭和社會造成了巨大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[9-10]，引起了全社會的高度關(guān)注。神經(jīng)干細(xì)胞具有自我復(fù)制、增殖的能力，定向分化的特征，被醫(yī)學(xué)界廣泛認(rèn)為在神經(jīng)退行性疾病的治療中干細(xì)胞治療占有十分重要的地位，已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。大量的研究表明：使用細(xì)胞因子或細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化成特定的功能性神經(jīng)細(xì)胞，直接修復(fù)和替代受損神經(jīng)細(xì)胞；另一方面移植的干細(xì)胞自身也能產(chǎn)生大量細(xì)胞因子參與修復(fù)損傷過程。神經(jīng)干細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞的治療最有可能成為該類疾病根治的希望。當(dāng)神經(jīng)干細(xì)胞以及攜帶目的基因或細(xì)胞因子的基因植入體內(nèi)，既可表達(dá)外源性基因，產(chǎn)生相應(yīng)的生長因子或細(xì)胞因子，誘導(dǎo)自身干細(xì)胞定向分化；又可補(bǔ)充神經(jīng)細(xì)胞的不足，達(dá)到基因治療和細(xì)胞替代的雙重作用[11]。

Figure 5. Structural gene containing neural stem cells in fluorescence intensity at each time point(×100). Mean±SEM．n=6.*P<0.05, **P<0.01 vs 1 d.

Figure 6. HSP70 of expression in neural stem cells. Mean±SEM．n=6.*P<0.05, **P<0.01 vs control.

“分子伴侶”在生物生命活動占有極其重要的地位，HSP70是最主要的成分和最重要的功能單位，它輔助形成特定的蛋白質(zhì)構(gòu)象并維持蛋白質(zhì)正常的構(gòu)象，既可幫助新合成多肽鍵的生理折疊與伸展，也可使未折疊的多肽鏈更加穩(wěn)定。當(dāng)機(jī)體發(fā)生異常時(shí)，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生異常變化導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯誤折疊并聚集; 可反應(yīng)性引起HSP70表達(dá)的上調(diào)，識別和結(jié)合異常蛋白質(zhì)，并通過ATP酶作用產(chǎn)生能量，改變蛋白的異常折疊，并輔助其重新折疊;保護(hù)正常蛋白質(zhì)不與變性蛋白質(zhì)相互結(jié)合，從而阻止蛋白質(zhì)的異常聚積。而許多神經(jīng)退行性疾病其發(fā)病的機(jī)制就是由于蛋白的異常折疊并聚合形成了毒性病理產(chǎn)物，引起了疾病的發(fā)生發(fā)展。其外，HSP70在機(jī)體應(yīng)激時(shí)加快正常蛋白質(zhì)合成，使應(yīng)激時(shí)造成的蛋白質(zhì)數(shù)量的減少得到補(bǔ)充，并可幫助維持蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，保證線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等正常功能的發(fā)揮。

在我們選取HSP70作為目的基因，神經(jīng)干細(xì)胞作為靶細(xì)胞，pEGFP-C2作為表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-C2/HSP70。而pEGFP-C2為一種帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因的真核表達(dá)載體,能將克隆至其中的目的片段高效表達(dá)并利于觀察。轉(zhuǎn)染采用Lonza公司發(fā)明的Nucleofector 轉(zhuǎn)染技術(shù)，該技術(shù)是將電穿孔技術(shù)和專用的優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑結(jié)合起來，對不同的細(xì)胞類型，采用最優(yōu)化的轉(zhuǎn)染程序。我們觀察到pEGFP-HSP70轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞效率達(dá) 50%左右，細(xì)胞的存活率近 85%。Nucleofector 技術(shù)與脂質(zhì)體及病毒轉(zhuǎn)染載體相比優(yōu)點(diǎn)明顯，可以更貼近臨床應(yīng)用，其外，操作較為簡單，轉(zhuǎn)染效率較高，尤其對懸浮的、難轉(zhuǎn)細(xì)胞優(yōu)勢明顯。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pEGFP-HSP70轉(zhuǎn)染干細(xì)胞后，其熒光強(qiáng)度及HSP70的表達(dá)與時(shí)間密切相關(guān)，轉(zhuǎn)染24 h至2周有較高的熒光強(qiáng)度及HSP70的表達(dá)，2周后衰減明顯，這為轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞選擇最佳移植治療時(shí)期提供了有價(jià)值的依據(jù)。神經(jīng)干細(xì)胞移植治療因蛋白折疊所致的退行性疾病是一種較有效的方法, 特別是當(dāng)神經(jīng)干細(xì)胞攜帶有靶向治療基因HSP70基因后,我們前期的實(shí)驗(yàn)已證明能明顯改善了AD模型鼠的行為學(xué)指標(biāo)，達(dá)到治療目的。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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