王 妮, 陳新玉, 歐小利, 姜 勇, 梅柱中

(南方醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，廣東省功能蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510515)

泛素(ubiquitin)存在于所有真核細(xì)胞中，是一種高度保守的含76個(gè)氨基酸殘基的蛋白，游離存在于細(xì)胞內(nèi)或共價(jià)綴合到各種胞漿、核和整合的膜蛋白上[1]?？赏ㄟ^(guò)其羧基端的甘氨酸殘基與靶蛋白分子中特定的賴氨酸殘基形成共價(jià)連接，被稱之為蛋白質(zhì)的泛素化修飾，是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種重要形式。依底物蛋白質(zhì)分子中形成的多聚泛素鏈的不同可促進(jìn)其通過(guò)26S泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system，UPS)被降解(如通過(guò)K48形成的多聚泛素鏈)或調(diào)節(jié)其在細(xì)胞中的功能(如通過(guò)K63形成的多聚泛素鏈)。蛋白質(zhì)的泛素化降解涉及3個(gè)步驟：第1步，泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)利用ATP激活泛素并與泛素以共價(jià)鍵結(jié)合；第2步，激活的泛素從E1轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,E2)；一些E2可直接把泛素傳給底物，大多數(shù)情況則需要第3步，即泛素連接酶(ubiquitin ligase,E3)識(shí)別特定的底物，并把泛素傳給底物賴氨酸[2]。其中E3連接酶處于核心的地位，它通過(guò)與底物蛋白質(zhì)的直接結(jié)合而促進(jìn)其發(fā)生泛素化修飾，保證了發(fā)生泛素化修飾的底物蛋白質(zhì)的特異性[3]。目前在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已經(jīng)被鑒定的E3連接酶超過(guò)600種，依據(jù)其結(jié)構(gòu)的不同可以大體上劃分為兩大類：HECT(homologous to E6AP C-terminus)家族蛋白和含有RING(really interesting new gene)結(jié)構(gòu)域的E3連接酶，其中前者是單一亞基的酶類，可直接促進(jìn)底物蛋白質(zhì)分子的泛素化修飾，而后者多是由多個(gè)亞基組成的，以蛋白復(fù)合物的形式來(lái)行使E3連接酶的活性[4]。

在含有RING結(jié)構(gòu)域的E3連接酶中，2003年被鑒定的含有BTB-Kelch結(jié)構(gòu)域的蛋白家族，即KLHL(Kelch-like)蛋白家族在其氨基末端含有保守的BTB(Bric-a-brac, Tramtrack and Broad complex)結(jié)構(gòu)域，在其羧基端含有5～6個(gè)Kelch結(jié)構(gòu)域，它們可通過(guò)BTB結(jié)構(gòu)域與Cul-3/Rbx1結(jié)合形成E3連接酶復(fù)合物，而通過(guò)其羧基端與底物蛋白質(zhì)分子結(jié)合[5-7]。該家族成員在進(jìn)化中高度保守，提示它們?cè)诩?xì)胞中具有重要的生理功能，但在已被鑒定的42種成員中，除了少數(shù)幾種之外，絕大部分成員的功能目前尚不清楚[8]。我們?cè)谇捌趯?duì)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)采用Toll樣受體5(Toll-like receptor 5，TLR5)的特異性配體鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白(flagellin fromS.typhimurium,ST-FLA)刺激CD11c+的小鼠小腸黏膜固有層(lamina propria)細(xì)胞4 h可誘導(dǎo)KLHL家族蛋白中的KLHL32表達(dá)水平下調(diào)[9](數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)GDS2212)，提示其可能與細(xì)胞的炎癥反應(yīng)調(diào)控有關(guān)。為了進(jìn)一步的分析KLHL32蛋白在炎癥反應(yīng)中的功能，我們用佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)誘導(dǎo)分化的人THP-1單核巨噬細(xì)胞克隆了該基因，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步的分析，為后續(xù)深入研究KLHL32蛋白在細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的功能打下了良好的基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

真核表達(dá)載體pcDNA3.1-FLAG、THP-1細(xì)胞系和人胚胎腎293(human embryonic kidney 293, HEK293)細(xì)胞(本室保存)；DNA Ladder、KOD Plus DNA聚合酶和ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo);限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶(Thermo);質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和SYBR Green Real-Time PCR試劑盒(Promega);TRIzol總RNA提取試劑和Lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染試劑盒(Life Technology);anti-FLAG M2抗體和PMA(Sigma-Aldrich);ST-FLA (Invivogen);anti-cullin-3(Cul-3)兔單克隆抗體(Epitomics);anti-mouse IgG, HRP-linked antibody(Cell Signaling Technology)。引物合成及測(cè)序由Life Technology完成。

2 主要方法

2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)C57BL/6小鼠不同組織KLHL32 mRNA的表達(dá) 頸椎脫臼法處死C57BL/6小鼠，將新鮮取出的心、肝、脾、肺、腎、腦、肌肉、皮膚等8種組織裝入凍存管中，置于液氮中進(jìn)行速凍，30 min后取出組織加一定量液氮充分研磨至完全粉碎。按每50 mg組織樣品加TRIzol? Reagent 1 mL的量加入適量的TRIzol試劑，提取組織中總RNA并采用real-time PCR檢測(cè)不同組織中KLHL32 mRNA的表達(dá)水平，以28S rRNA為內(nèi)參照。小鼠KLHL32上游引物5’-CAGCAAAGAAGTGATGGCATTC-3’, 下游引物5’-GCTCCACTTTCCACCATACAAAG-3’；小鼠28S rRNA上游引物5’-GAGATTCCCACTGTCCCTACCTACT-3’，下游引物5’-GAGTCAAGCTCAACAGGGT-CTTC-3’。

2.2PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的分化及采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)KLHL32 mRNA的表達(dá)水平變化 THP-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640 于37 ℃、5% CO2條件下在3.5 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。PMA誘導(dǎo)THP-1分化為巨噬細(xì)胞參考已發(fā)表文獻(xiàn)[10]，取3×105THP-1單核細(xì)胞接種于3.5 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入10 μg/L PMA，混勻后置37 ℃培養(yǎng)48 h，吸棄培養(yǎng)基，采用PBS緩沖液洗2次，再加入無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后吸棄無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，加入含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，同時(shí)加入TLR5激活劑ST-FLA至終濃度為100 μg/L。置37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后收集細(xì)胞，采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，并測(cè)定其濃度和純度。以Roche公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，人KLHL32上游引物5’-GCGACATCACCCTGATTGCT-3’，下游引物5’-CATCAGCTCCACTTTCCACCAT-3’；內(nèi)參照人β-actin上游引物5’-TGGCACCACACCTTCTACAATG-3’，下游引物5’-TCTCAAACATGATCTGGGTCATCT-3’。具體方法參照Invitrogen公司SYBR Green Real-Time PCR試劑盒說(shuō)明書。

2.3pcDNA3.1-KLHL32-FLAG真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以上述反轉(zhuǎn)錄的THP-1細(xì)胞cDNA為模板，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增人KLHL32基因的編碼序列。PCR上游引物5′-GTGGTACCGCTGGAAAATGCCGTCTGAAC-3′(下劃線為KpnI位點(diǎn))，下游引物5′-GCTCTAGAGATGGTGCCAATCCTGTGATG-3′(下劃線為XbaI位點(diǎn))，擴(kuò)增片段大小為1 884 bp。采用高保真DNA聚合酶KOD Plus進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94 ℃ 30 s, 60 ℃ 1 min,68 ℃ 2 min，共35個(gè)循環(huán)。將經(jīng)KpnI和XbaI雙酶切的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至采用同樣雙酶切的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-FLAG中，重組質(zhì)粒經(jīng)限制性酶切鑒定與DNA測(cè)序證實(shí)，命名為pcDNA3.1-KLHL32-FLAG，表達(dá)的蛋白為羧基端含有FLAG標(biāo)簽的KLHL32融合蛋白。

2.4KLHL32蛋白BTB結(jié)構(gòu)域突變體質(zhì)粒的構(gòu)建 通過(guò)將KLHL32蛋白的BTB結(jié)構(gòu)域與Keap1和MEL-26蛋白的BTB結(jié)構(gòu)域采用Clustal多序列對(duì)位排列軟件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示它們之間具有高度的同源性，其中Val83/Leu85/Gly87與已報(bào)道的MEL-26蛋白和人Keap1蛋白BTB結(jié)構(gòu)域中參與同Cul-3蛋白相互結(jié)合的氨基酸殘基高度同源[7, 11](圖1)。為了分析它們對(duì)KLHL32與Cul-3結(jié)合的可能影響，以pcDNA3.1-KLHL32-FLAG質(zhì)粒為模板，采用QuickChange點(diǎn)突變?cè)噭┖?Stratagene)將它們同時(shí)突變?yōu)锳la。突變引物1序列5′-GTGGAGCTGATGAGGCTAATGCGCACGCTGTGACCAGCCTTG-3′，引物2序列5′-CAAGGCTGGTCACAGCGTGCGCATTAGCCTCATCAGCTCCAC-3′。 具體的操作依據(jù)其說(shuō)明書進(jìn)行，獲得的陽(yáng)性克隆經(jīng)DNA序列分析驗(yàn)證后備用，命名為pcDNA3.1-KLHL32M-FLAG。

Figure 1. Alignment of BTB domains from human KLHL32, Keap1 and MEL-26.

2.5脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和表達(dá) HEK293細(xì)胞用含有10% FBS的DMEM，置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h內(nèi)傳代并將細(xì)胞接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待其長(zhǎng)至約70%融合時(shí)，根據(jù)Invitrogen公司Lipofectamine? LTX and PLUSTMReagents試劑盒說(shuō)明書操作，轉(zhuǎn)染1 μg重組質(zhì)粒pcDNA3.1-KLHL32-FLAG和空載體質(zhì)粒pcDNA3.1-FLAG (對(duì)照)。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.6免疫共沉淀與Western blotting檢測(cè) 轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，采用300 μL細(xì)胞裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0, 0.2% Triton X-100, 150 mmol/L NaCl, 5% glycerol, 2 mmol/L EGTA, 1 mmol/L DTT，1×蛋白酶抑制劑)裂解細(xì)胞(冰浴1 h)，然后于12 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清。取30 μL細(xì)胞裂解上清加入10 μL 4×SDS-PAGE上樣緩沖液，95 ℃ 5 min，為細(xì)胞全裂解液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。在剩余的裂解上清中各加? μL抗FLAG單克隆抗體，置旋轉(zhuǎn)混勻儀上4 ℃孵育4 h，然后再加入20 μL protein A/G瓊脂糖凝膠，4 ℃孵育過(guò)夜，再采用裂解緩沖液洗瓊脂糖凝膠4次，最后一次離心后吸棄上清，于每管中加入40 μL的2×SDS-PAGE上樣緩沖液，95 ℃ 5 min，為免疫共沉淀樣品。分別將全細(xì)胞裂解液與免疫共沉淀樣品采用12% SDS-PAGE進(jìn)行分離，電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)移至NC膜。經(jīng)5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉1 h后，再與1∶2 000稀釋的Ⅰ抗4 ℃孵育過(guò)夜，然后與1∶2 000稀釋的HRP偶聯(lián)的抗鼠IgG室溫孵育1 h后，采用Pierce公司的SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色，利用Kodak IS2000R 圖像工作站進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 KLHL32蛋白的鑒定

通過(guò)對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的進(jìn)一步分析，我們發(fā)現(xiàn)人KLHL32基因定位于染色體的6q16.1區(qū)，全長(zhǎng)216 kb，編碼蛋白含有620個(gè)氨基酸殘基，含有1個(gè)BTB結(jié)構(gòu)域與5個(gè)重復(fù)的Kelch結(jié)構(gòu)域，在這2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間還存在1個(gè)BACK(BTB and C-terminal Kelch)結(jié)構(gòu)域，見(jiàn)圖2。該蛋白在進(jìn)化中高度保守，如爪蟾KLHL32蛋白與人KLHL32蛋白的保守性高達(dá)95%，提示其在生物體內(nèi)可能具有非常重要的功能。

Figure 2. Schematic diagram of BTB protein KLHL21.

2 KLHL32 mRNA在小鼠不同組織中的表達(dá)水平

用β-actin為內(nèi)參照，采用定量PCR對(duì)KLHL32 mRNA在小鼠腦、心、肝、脾、肺、腎、肌肉與皮膚等8種組織中表達(dá)水平的分析結(jié)果顯示，KLHL32 mRNA在腦里面的表達(dá)水平最高，其次為心與腎組織，而在皮膚里的表達(dá)水平最低，當(dāng)以肺內(nèi)的KLHL32表達(dá)水平為基準(zhǔn)時(shí)(設(shè)為1)，則其在另外7種組織中的相對(duì)表達(dá)水平依次為：腦29.94±2.21、心12.88±1.53、肝0.21±0.05、脾0.09±0.04、腎12.52±1.25、肌肉0.78±0.26與皮膚0.43±0.14，見(jiàn)圖3。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果的可靠性，我們又用28S rRNA為內(nèi)參照重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示當(dāng)以肺內(nèi)的KLHL32表達(dá)水平為基準(zhǔn)時(shí)(設(shè)為1)，則其在另外7種組織中的相對(duì)表達(dá)水平依次為：腦17.39±2.52、心6.88±3.49、肝0.11±0.03、脾0.15±0.08、腎5.98±2.52、肌肉0.27±0.11與皮膚0.002±0.001，與采用β-actin為內(nèi)參照的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，只是比例上存在差異(圖未顯示)。

3 ST-FLA激活TLR5受體誘導(dǎo)KLHL32 mRNA表達(dá)下調(diào)

Figure 3. Relative expression of KLHL32 mRNA in different tissues of mouse.Mean±SEM. n=3.

100 μg/L ST-FLA刺激THP-1巨噬細(xì)胞4 h可誘導(dǎo)KLHL32 mRNA水平顯著下調(diào)(0.57±0.07，P<0.01)，而作為陽(yáng)性對(duì)照的IL-8表達(dá)水平上調(diào)，為未誘導(dǎo)時(shí)的(7.03±1.89)倍(P<0.01)，提示KLHL32可能參與了TLR5激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，見(jiàn)圖4。

Figure 4. The mRNA expression of KLHL32 was down-regulated in THP-1 cells upon ST-FLA treatment.Mean±SEM. n=3. **P<0.05 vs control.

4 KLHL32蛋白對(duì)NF-κB報(bào)告基因表達(dá)的影響

KLHL32蛋白對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性沒(méi)有明顯影響，見(jiàn)圖5。

5 KLHL32與Cul-3蛋白在HEK293細(xì)胞中存在相互結(jié)合

在HEK293細(xì)胞中，KLHL32蛋白與Cul-3蛋白之間存在特異性的結(jié)合。為了進(jìn)一步分析KLHL32蛋白中的BTB結(jié)構(gòu)域是否參與了與Cul-3蛋白的結(jié)合，將其保守的氨基酸殘基Val83/Leu85/Gly87同時(shí)突變成丙氨酸(Ala)，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該突變體在細(xì)胞中與Cul-3蛋白不能結(jié)合，表明KLHL32是通過(guò)其氨基端的BTB結(jié)構(gòu)域與Cul-3蛋白相互結(jié)合，見(jiàn)圖6。

Figure 5. Over-expression of KLHL32 in HEK293 cells didn’t interfere the activation of NF-κB upon TNF-α treatment.Mean±SEM.n=3.

Figure 6. KLHL32 interacted with Cul-3 protein through its BTB domain.

討 論

KLHL32蛋白屬于進(jìn)化中高度保守KLHL蛋白家族，該家族成員可通過(guò)其氨基端的BTB結(jié)構(gòu)域與Cul-3蛋白相互結(jié)合形成E3泛素連接酶，催化底物蛋白質(zhì)的泛素化修飾，但目前對(duì)KLHL32蛋白的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究首先通過(guò)NCBI高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的分析，發(fā)現(xiàn)特異性激活CD11c+的小鼠小腸黏膜固有層細(xì)胞中的TLR5受體4 h可誘導(dǎo)KLHL家族蛋白中的KLHL32表達(dá)水平的下調(diào)。為了驗(yàn)證這一結(jié)果，我們采用TLR5特異性配體ST-FLA激活經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化的THP-1巨噬細(xì)胞，結(jié)果顯示激活TLR5受體確實(shí)可以誘導(dǎo)KLHL32 mRNA表達(dá)水平的下調(diào)，提示KLHL32蛋白可能參與了TLR5受體下游信號(hào)通路的調(diào)控。

TLR5受體主要表達(dá)于單核細(xì)胞，在巨噬細(xì)胞中低表達(dá)，其特異性配體是細(xì)菌的鞭毛蛋白。其被激活后可通過(guò)接頭蛋白MyD88的介導(dǎo)，激活下游NF-κB轉(zhuǎn)錄因子與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)，繼而促進(jìn)促炎細(xì)胞因子(pro-inflammatory cytokine)如TNF-α、白細(xì)胞介素1與I型干擾素等的表達(dá)，構(gòu)成宿主對(duì)抗細(xì)菌感染的第一道防線[12]。本結(jié)果顯示KLHL32蛋白對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性并無(wú)明顯影響，其具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)揭示。

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了KLHL32蛋白在細(xì)胞中與Cul-3之間存在相互作用，而且它們之間的相互結(jié)合依賴于其氨基端保守的BTB結(jié)構(gòu)域，提示其在細(xì)胞中可能是一種潛在的E3泛素連接酶，催化底物蛋白質(zhì)分子的泛素化修飾。泛素化修飾是蛋白質(zhì)一種重要的翻譯后修飾形式，它在細(xì)胞中不僅可以促使靶蛋白分子通過(guò)泛素蛋白酶體途徑被降解，也可以參與調(diào)控靶蛋白質(zhì)分子在細(xì)胞中的定位與功能，而近年來(lái)的研究表明，蛋白質(zhì)的泛素化修飾在TLR受體被激活后的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著不可或缺的作用[13]。為了分析KLHL32蛋白在炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的可能作用，我們將其與受NF-κB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的報(bào)告基因表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，然后再采用TNF-α進(jìn)行刺激，結(jié)果顯示KLHL32蛋白對(duì)TNF-α激活的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性沒(méi)有明顯影響。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是因?yàn)門NFR1受體被TNF-α激活與TLR5受體被激活后的下游信號(hào)通路不同所致，也可能是因?yàn)閳?bào)告基因檢測(cè)所采用的是HEK293細(xì)胞，而非TLR5表達(dá)的單核細(xì)胞如PMA誘導(dǎo)分化的THP-1細(xì)胞。此外，KLHL32蛋白在細(xì)胞中也有可能并不參與對(duì)TLR5激活的NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控，而是參與對(duì)其它下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如MAPK通路的調(diào)控。對(duì)KLHL32蛋白功能的深入研究有賴于鑒定其特異性的底物蛋白分子，并分析其促進(jìn)底物蛋白泛素化修飾對(duì)底物蛋白功能的影響。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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