ANCA誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放正五聚素蛋白3*

謝 京， 唐 莎， 張 瑩， 尹仕偉， 高雪靜， 施維維， 王 莉， 鄒麗云， 吳玉章， 張靜波△

(第三軍醫(yī)大學(xué) 1新橋醫(yī)院腎內(nèi)科， 2全軍免疫學(xué)研究所，重慶 400037)

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(antineutrophil cytoplasmic autoantibody, ANCA)相關(guān)性血管炎(ANCA-associated vasculitis, AAV)是一種自身免疫性疾病，在我國(guó)并不少見(jiàn)。該病變屬于慢性自身炎癥狀態(tài)持續(xù)進(jìn)行的系統(tǒng)性小血管炎(systemic small-vessel vasculitis, SSV)，腎臟是最常累及的器官，可導(dǎo)致迅速進(jìn)展、不可逆轉(zhuǎn)的腎功能衰竭[1]。正五聚素蛋白3 (pentraxin 3, PTX3) 作為一種新的與C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)同為正五聚素蛋白家族的急性期反應(yīng)蛋白，與CRP相比，更能迅速反映局部組織的炎癥狀態(tài)及損傷，有望成為臨床更為敏感的血清學(xué)標(biāo)志物[2]。PTX3以預(yù)存的方式存在于中性粒細(xì)胞中[3]。溶酶體膜蛋白2(lysosomal membrane protein 2，LAMP-2)抗體是最近才發(fā)現(xiàn)的ANCA 新亞型，新近研究顯示LAMP-2抗體介導(dǎo)了AAV的自身免疫發(fā)病過(guò)程[4]，與AAV的診斷及活動(dòng)性高度相關(guān)[5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，LAMP-2抗體可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞胞外捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps, NETs) 形成[6]。本研究旨在進(jìn)一步探討傳統(tǒng)ANCA及新型LAMP-2抗體是否能直接誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞活化，是否通過(guò)NETs形成釋放PTX3，為PTX3是否參與ANCA相關(guān)性血管炎的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

二甲苯基碘(diphenyleneiodonium, DPI)和二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)自Sigma-Aldrich；HBSS(無(wú)Ca2+、Mg2+)、PRMI-1640培養(yǎng)基(無(wú)酚紅)和青/鏈霉素液購(gòu)自Invitrogen；12 mm圓形蓋玻片購(gòu)自Fisher；PolymorphprepTM分離液購(gòu)自Axis-Shield；紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自Roche；免疫染色固定液、免疫染色封閉液、免疫染色Ⅰ抗稀釋液、免疫染色熒光Ⅱ抗稀釋液、抗熒光淬滅封片劑、DAPI等購(gòu)自上海碧云天公司。TNF-α購(gòu)自PeproTech；PTX3 ELISA試劑盒購(gòu)自Cusabio，檢測(cè)范圍為0.156～10 μg/L；FITC標(biāo)記的抗人CD16流式抗體購(gòu)自BioLegend；抗LAMP-2 IgG(H4B4)、FITC標(biāo)記小鼠抗人髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)單抗(266.6k2)和小鼠抗人PTX3 IgG抗體均購(gòu)自Santa Cruz；小鼠抗人IgG2a單克隆抗體購(gòu)自Abcam；所有熒光Ⅱ抗包括TRITC標(biāo)記的羊抗小鼠熒光Ⅱ抗購(gòu)自北京中衫金橋公司。

2 主要方法

2.1健康對(duì)照組及AAV患者全血及血清收集 選擇健康志愿者9例作為對(duì)照組，來(lái)源于第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院體檢中心；AAV患者6例，來(lái)源于第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院腎內(nèi)科，入選標(biāo)準(zhǔn)為：2012年美國(guó)Chapel Hill會(huì)議(CHCC)關(guān)于系統(tǒng)性血管炎命名分類法、分型及1999年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)修訂的血管炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。排除標(biāo)準(zhǔn)為：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及過(guò)敏性紫癜、IgA腎病等繼發(fā)性的血管炎和近期接受免疫抑制劑治療的患者?；颊咂骄挲g60.2歲,男性2例，女性4例。其中血清MPO-ANCA陽(yáng)性5例，且平均滴度1∶68.4；PR3-ANCA陽(yáng)性 1例，滴度1∶100。腎活檢其中3例為新月體腎小球腎炎，1例硬化性腎小球腎炎，2例因雙腎彩超提示血流信號(hào)稀少及縮小未進(jìn)行腎活檢。全血和血清均為在臨床確診，接受治療前收集樣本。健康志愿者和AAV患者血清收集后，經(jīng)2 000 r/min離心15 min后，取上清液置于Eppendorf管，于-80 ℃冰箱保存。本研究經(jīng)第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

2.2中性粒細(xì)胞的分離、存活率鑒定及培養(yǎng) 采用PolymorphprepTM分離液分離健康志愿者和AAV患者EDTA抗凝全血，加入中性粒細(xì)胞分離液后離心，取出中性粒細(xì)胞層和下面的分離液層，加入HBSS(無(wú)Ca2+、Mg2+)洗滌后裂解殘余紅細(xì)胞，CD16標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)鑒定中性粒細(xì)胞純度。細(xì)胞用無(wú)酚紅RPMI- 1640培養(yǎng)基(1%青/鏈霉素)以5×(105～106)接種于加有12 mm圓形蓋玻片的24孔板中，每孔500 μL，貼片1 h后，分別設(shè)立相應(yīng)的刺激組進(jìn)行培養(yǎng)。分離后0 h及培養(yǎng)3 h的中性粒細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，取細(xì)胞懸液450 μL與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液50 μL以9∶1輕輕混合混勻(終濃度0.04%)；倒置顯微鏡下觀察并拍照，死細(xì)胞染成明顯的藍(lán)色，活細(xì)胞拒染呈無(wú)色透明狀。在3 min內(nèi)分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞：細(xì)胞存活率(%)= 活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。

2.3實(shí)驗(yàn)分組 分離健康志愿者中性粒細(xì)胞進(jìn)行分組培養(yǎng)：(1) LAMP-2抗體刺激組：采用抗LAMP-2 IgG (20 mg/L)，參照文獻(xiàn)[6]； TNF-α組：TNF-α(20 μg/L)，刺激為陽(yáng)性對(duì)照，參照文獻(xiàn)[9]。(2)血清刺激中性粒細(xì)胞組：AAV患者血清作為實(shí)驗(yàn)組，TNF-α+AAV患者血清作為陽(yáng)性對(duì)照，健康人血清組作為陰性對(duì)照，刺激時(shí)間180 min。TNF-α組預(yù)處理60 min后，再用患者血清刺激120 min。培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。(3)健康志愿者及AAV患者中性粒細(xì)胞上清組：收集健康志愿者及AAV患者全血分離后的中性粒細(xì)胞上清待測(cè)。僅加培養(yǎng)基的中性粒細(xì)胞作為空白對(duì)照組。

2.4免疫熒光及激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)PTX3的表達(dá) 分離后的中性粒細(xì)胞經(jīng)處理或未處理后固定，洗滌3次后4 ℃封閉過(guò)夜，以小鼠抗人PTX3-IgG為Ⅰ抗，以稀釋好的TRITC 羊抗小鼠熒光IgG抗體(1∶200)作為Ⅱ抗標(biāo)記PTX3；FITC標(biāo)記的抗中性粒細(xì)胞顆粒蛋白熒光抗體，37 ℃孵育60 min，洗滌3次后，DAPI復(fù)染標(biāo)記DNA，抗熒光淬滅封片劑封片后以Leica SP5激光共聚焦顯微鏡觀察和記錄熒光圖像，用Image-Pro Plus圖像分析軟件測(cè)量熒光強(qiáng)度，結(jié)果以目的蛋白的平均熒光強(qiáng)度值表示。

2.5ELISA法測(cè)定各組細(xì)胞上清PTX3水平 中性粒細(xì)胞經(jīng)分組處理培養(yǎng)后，收集上清液，步驟嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)，用酶標(biāo)儀分析出波長(zhǎng)450 nm處的A值，代入CurveExpert 1.4軟件，分析ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程及數(shù)據(jù)，計(jì)算出各組細(xì)胞上清液中PTX3水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)每次采用3個(gè)復(fù)孔。中性粒細(xì)胞來(lái)源于9個(gè)不同的健康志愿者。用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 分離的中性粒細(xì)胞純度及存活率

分離的健康志愿者中性粒細(xì)胞經(jīng)CD16標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)鑒定，純度>95%。剛分離(0 h)的健康志愿者中性粒細(xì)胞平均存活率為97%，AAV患者的中性粒細(xì)胞平均存活率95.7%，2組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。健康志愿者中性粒細(xì)胞體外經(jīng)過(guò)3 h的培養(yǎng)，單獨(dú)培養(yǎng)基組平均存活率為94.9%，健康志愿者血清刺激組平均存活率為95.2%，LAMP-2抗體(20 mg/L)刺激組平均存活率為94.0%，AAV血清刺激組平均存活率為94.2%，TNF-α刺激組平均存活率為93.5%，AAV血清+TNF-α刺激組平均存活率為94.9%，各組間無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The survival rate of neutrophils tested by Trypan blue exclusion assay.HC: health control.Mean±SD.n=3.

2 PTX3儲(chǔ)存在靜止?fàn)顟B(tài)的正常中性粒細(xì)胞中

分離的健康志愿者中性粒細(xì)胞，不予以任何刺激，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)180 min，然后用 DAPI 進(jìn)行核染色，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)變化，絕大多數(shù)中性粒細(xì)胞保持正常的分葉核結(jié)構(gòu)，間接免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)PTX3儲(chǔ)存在靜止?fàn)顟B(tài)的中性粒細(xì)胞中，細(xì)胞外無(wú)PTX3的釋放，見(jiàn)圖2。

Figure 2. PTX3 was stored in resting normal neutrophils. Scale bars:25 μm.

3 AAV患者中性粒細(xì)胞釋放PTX3增加

由健康人及AAV患者外周血分離的中性粒細(xì)胞直接離體培養(yǎng)180 min后，收集培養(yǎng)上清，經(jīng)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)來(lái)自AAV患者中性粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)上清中的PTX3水平明顯高于健康人中性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清中的PTX3水平，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖3。

4 LAMP-2抗體促中性粒細(xì)胞PTX3的釋放

分離健康志愿者的中性粒細(xì)胞分別經(jīng)培養(yǎng)基(作為對(duì)照)、LAMP-2 抗體(20 mg/L)和TNF-α刺激180 min 后，收集培養(yǎng)上清，通過(guò)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：LAMP-2抗體刺激健康人外周血中性粒細(xì)胞組，上清中PTX3水平明顯高于培養(yǎng)基對(duì)照組(P<0.01),但低于陽(yáng)性對(duì)照的TNF-α組。3組間均有顯著差異(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

5 LAMP-2抗體及AAV患者血清可通過(guò)NETs的形成釋放PTX3

分離健康志愿者的中性粒細(xì)胞經(jīng)LAMP-2 抗體或TNF-α分別刺激180 min 后，用DAPI 進(jìn)行核染色，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)變化。在未加任何刺激因子的培養(yǎng)基陰性對(duì)照組，絕大多數(shù)中性粒細(xì)胞保持正常的分葉核結(jié)構(gòu)，PTX3固定在胞內(nèi)，幾乎無(wú)PTX3的釋放；LAMP-2 抗體刺激組中性粒細(xì)胞核變形，分葉消失，染色質(zhì)解聚呈網(wǎng)狀釋放出胞外，發(fā)現(xiàn)大量PTX3釋放；TNF-α刺激組同樣發(fā)現(xiàn)大量PTX3釋放；分離的中性粒細(xì)胞經(jīng)健康人血清刺激后絕大多數(shù)中性粒細(xì)胞保持正常的分葉核結(jié)構(gòu)，且PTX3固定在胞內(nèi)；AAV患者血清刺激組中性粒細(xì)胞核變形，分葉消失，染色質(zhì)解聚呈網(wǎng)狀釋放出胞外，發(fā)現(xiàn)大量PTX3釋放；TNF-α預(yù)刺激后加AAV患者血清組同樣發(fā)現(xiàn)大量PTX3釋放。通過(guò)圖像分析軟件測(cè)量PTX3免疫熒光強(qiáng)度顯示，與單獨(dú)培養(yǎng)基組相比，LAMP-2抗體刺激組的PTX3免疫熒光強(qiáng)度明顯增高，2組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；用AAV患者血清刺激正常人中性粒細(xì)胞組明顯高于健康血清刺激組，2組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

Figure 3. High supernatant PTX3 level in cultured neutrophils isolated from the AAV patients.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs health control (HC).

Figure 4. PTX3 was released from the neutrophils stimulated by LAMP-2 antibody (Ab). Mean±SD.n=9.**P<0.01 vs medium.

Figure 5. PTX3 was released through neutrophils extracelluar trap formation.Scale bars:25 μm. Mean±SD.n=9.**P<0.01 vs medium; ##P<0.01 vs HC serum.

6 PTX3隨中性粒細(xì)胞胞內(nèi)抗原MPO通過(guò)NETs形成釋放

分離健康志愿者的中性粒細(xì)胞經(jīng)LAMP-2抗體或TNF-α刺激180 min 后，對(duì)刺激后的中性粒細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，用小鼠抗人PTX3 IgG抗體作為Ⅰ抗、TRITC羊抗小鼠IgG2a單克隆抗體及FITC標(biāo)記的抗MPO熒光抗體作為Ⅱ抗，DAPI 標(biāo)記DNA，激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，LAMP-2 抗體誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs，導(dǎo)致PTX3隨MPO一起釋放，見(jiàn)圖6。

討 論

AAV是進(jìn)展非常迅速的系統(tǒng)性疾病，ANCA 不僅是診斷AAV的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也直接參與了病理?yè)p傷進(jìn)程[9]。但ANCA并不與所有病人的活動(dòng)性相關(guān)，提示還存在其它伴隨疾病活動(dòng)的生物學(xué)標(biāo)志[10-11]。既往研究發(fā)現(xiàn)，PTX3可以作為AAV患者疾病活動(dòng)性的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[12]，但具體機(jī)制依然不清。

Figure 6. PTX3 was released along with MPO through the neutrophil extracelluar trap formation. Scale bars: 25 μm.

PTX3是近年發(fā)現(xiàn)的，與短肽鏈的CRP和SAP同家族的一種新的長(zhǎng)肽鏈正五聚素蛋白。PTX3可由眾多炎癥細(xì)胞及組織固有細(xì)胞產(chǎn)生。這些細(xì)胞包括：樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、激活的內(nèi)皮細(xì)胞、腎臟系膜細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等，還以預(yù)存的方式儲(chǔ)存于中性粒細(xì)胞的特殊顆粒里[13]，作為一種可溶性模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，在炎癥因子及病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)刺激下可釋放出胞外[14]。PTX3通過(guò)巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)晚期凋亡中性粒細(xì)胞的清除，參與了自身免疫[15-16]；此外，還通過(guò)與C1q的結(jié)合，激活補(bǔ)體途徑，而在補(bǔ)體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中起到雙重作用[17]。本研究首先從形態(tài)學(xué)上證實(shí)了PTX3儲(chǔ)備在正常并處于靜止?fàn)顟B(tài)的中性粒細(xì)胞中，然后在臨床收集的AAV患者全血中分離的中性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測(cè)到PTX3水平明顯高于健康對(duì)照組，提示AAV患者的中性粒細(xì)胞可能釋放PTX3增加。有文獻(xiàn)顯示：中性粒細(xì)胞受TNF-α刺激后發(fā)生凋亡，儲(chǔ)存在中性粒細(xì)胞特殊顆粒內(nèi)的PTX3隨即釋放出胞外[14]。

NETs是一種不同于凋亡和壞死的中性粒細(xì)胞一種新的死亡方式，是以中性粒細(xì)胞核內(nèi)或線粒體內(nèi)DNA及組蛋白為骨架，負(fù)載胞內(nèi)抗微生物分子組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，作為中性粒細(xì)胞抵御外來(lái)微生物的第一道防線，以胞吐的方式釋放DNA及水解酶，捕獲入侵的病原微生物，形成高濃度的殺菌微環(huán)境[18]。NETs釋放的組分中，經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)定，有24種NETs相關(guān)性蛋白[19]，這些蛋白基本上都具有抗微生物活性，與宿主防御相關(guān)，PTX3即為其中之一[13]。本研究隨后采用ANCA新亞型LAMP-2抗體刺激正常人中性粒細(xì)胞，同樣發(fā)現(xiàn)其培養(yǎng)上清中存在高水平的PTX3蛋白，進(jìn)一步采用免疫熒光方法從形態(tài)學(xué)證實(shí)了PTX3的釋放，以及熒光強(qiáng)度定量檢測(cè)到刺激后的中性粒細(xì)胞PTX3釋放增加。同樣，含ANCA陽(yáng)性的AAV患者血清體外刺激正常人中性粒細(xì)胞，與LAMP-2抗體刺激具有相似的結(jié)果，免疫熒光及熒光強(qiáng)度定量檢測(cè)到患者血清刺激后的中性粒細(xì)胞釋放出大量的PTX3。這提示PTX3釋放可能依賴于ANCA及其它微環(huán)境細(xì)胞因子， ANCA新亞型LAMP-2抗體與AAV血清中檢驗(yàn)確定的傳統(tǒng)ANCA(MPO-ANCA及PR3-ANCA)一樣，都能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的PTX3釋放。本課題組早期研究發(fā)現(xiàn)：LAMP-2抗體誘導(dǎo)的NETs網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組分中含有MPO等自身抗原[6]。自身抗原的過(guò)度暴露而未及時(shí)清除，可以直接損傷機(jī)體組織，還能進(jìn)一步誘導(dǎo)自身抗體的形成，加重AAV的發(fā)病進(jìn)程[9]。我們用激光共聚焦顯微鏡觀察，從形態(tài)學(xué)上發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞通過(guò)NETs形成導(dǎo)致PTX3隨自身抗原MPO一同釋放，PTX3構(gòu)成NETs的組份。PTX3作為可溶性識(shí)別受體，具有類似抗體的功效，可能在NETs中通過(guò)與某種配體的結(jié)合，清除過(guò)度暴露的自身抗原，清除異常死亡的中性粒細(xì)胞，發(fā)揮出中和清除病原體的生物學(xué)效應(yīng)，而起到限制自身免疫的保護(hù)性作用[20-21]。

本研究尚有以下不足之處：因本課題組在臨床研究部分發(fā)現(xiàn)AAV患者血清PTX3水平升高，與文獻(xiàn)報(bào)道的小血管炎患者血清中PTX3水平升高相似[12]。因此，在用AAV患者血清刺激組中，考慮到患者血清中含有PTX3，與正常人外周血中性粒細(xì)胞經(jīng)其刺激后釋放出的PTX3相互產(chǎn)生干擾，尚未設(shè)立用AAV患者血清刺激正常人外周血中性粒細(xì)胞組。僅用熒光檢測(cè)從形態(tài)學(xué)上發(fā)現(xiàn)了與抗體刺激組相同的PTX3釋放。無(wú)論是體外或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步探討PTX3在AAV中的作用是本研究需要繼續(xù)關(guān)注的問(wèn)題。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)靜止?fàn)顟B(tài)的正常中性粒細(xì)胞中儲(chǔ)存PTX3，AAV患者外周血中性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在高水平PTX3，而這些PTX3可由中性粒細(xì)胞通過(guò)胞外捕網(wǎng)形成進(jìn)行釋放。該發(fā)現(xiàn)將為我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)這一特殊的可溶性識(shí)別受體在AAV病理生理過(guò)程中的作用及可能機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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