Tryptase和TIM-1雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞在不同程度人牙周炎組織中的量化研究*

李 娟， 尹小萍， 藍(lán) 田， 呂芳麗， 黃 博， 陳 柯， 黃世光△

(1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系, 廣東 廣州 510632； 2中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)教研室，廣東 廣州 510080；3廣州市婦女兒童醫(yī)療中心口腔科，廣東 廣州 510623)

T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白1(T-cell immunoglobulin mucin 1，TIM-1)作為一種免疫調(diào)節(jié)分子，并能影響肥大細(xì)胞的功能[1]。我們前期的研究顯示肥大細(xì)胞的募集和脫顆粒、肥大細(xì)胞Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)與牙周炎的嚴(yán)重程度相關(guān)，提示肥大細(xì)胞在牙周炎的發(fā)病及病理過(guò)程中起重要作用[2-4]。研究顯示TIM-1可能發(fā)揮雙向的免疫調(diào)節(jié)作用[5]。目前類(lèi)胰蛋白酶(tryptase)和TIM-1雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞與牙周炎的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)免疫熒光雙染色方法觀察分析不同病變程度牙周炎牙齦組織中tryptase和TIM-1雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞的表達(dá)，探討tryptase和TIM-1雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞在牙周炎發(fā)病中的作用。

材 料 和 方 法

1 研究對(duì)象

1.1牙周炎病例選擇 選擇2010年1月～2013年1月在暨南大學(xué)荔灣口腔教學(xué)醫(yī)院牙周科就診的25～65歲成年人共92例，其中男性47例[(46±13)歲],女性45例[(42±14)歲]，所有患者均無(wú)糖尿病和其它系統(tǒng)疾病；納入標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)美國(guó)牙周病學(xué)會(huì)1999年的牙周病新分類(lèi)指南[6]；所有受試者均在取材前1周先行齦上和齦下刮治術(shù)，并簽署知情同意書(shū)。

1.2分組及取材 (1)正常對(duì)照組27例，取自因正畸治療需要拔除的牙周健康的前磨牙：牙齦無(wú)炎癥、無(wú)牙周袋、無(wú)附著喪失、X線片顯示無(wú)牙槽骨吸收； (2)輕度牙周炎組34例，為需要接受臨床牙冠延長(zhǎng)術(shù)的慢性牙周炎患者：牙齦有炎癥、探診出血、牙周袋≤4 mm、附著喪失≤2 mm、X線片顯示牙槽骨吸收不超過(guò)根長(zhǎng)的1/3；(3)重度牙周炎組31例，取自無(wú)保留價(jià)值或預(yù)后極差需要拔除的重度牙周炎患者：牙周袋>6 mm、附著喪失≥5 mm、X線片顯示牙槽骨超過(guò)根長(zhǎng)的1/2、甚至達(dá)根長(zhǎng)的2/3、多根牙有根分叉病變、牙齒多有松動(dòng)、炎癥明顯或可發(fā)生牙周膿腫。本研究未收集到中度牙周炎的牙齦標(biāo)本。

2 方法

2.1組織標(biāo)本采集、處理與觀察 牙齦標(biāo)本于4%中性甲醛液中固定48 h以上，制成頰舌向5 μm厚度連續(xù)切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察牙齦組織學(xué)改變。由2名病理醫(yī)師盲法觀察，并對(duì)牙齦組織的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況進(jìn)行評(píng)分，求其平均值。炎癥程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Huang等[7]的方法：0：無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；1：輕度炎癥，炎癥細(xì)胞局部呈小灶狀浸潤(rùn)；2：中度炎癥，炎癥細(xì)胞呈灶狀及片狀浸潤(rùn)；3：重度炎癥，炎癥細(xì)胞在牙齦組織內(nèi)呈彌漫性浸潤(rùn)。

2.2Tryptase和TIM-1雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞免疫熒光雙染色法 免疫熒光雙染色：Ⅰ抗tryptase抗體(Abcam，稀釋濃度為1∶200)和TIM-1抗體(武漢博士德，稀釋濃度為1∶100)；Ⅱ抗山羊抗鼠IgG(H+L)Alex Flour? 488(Cell Signaling Technology)和山羊抗兔IgG(H+L)Alex Flour?555(Cell Signaling Technology)，稀釋濃度為1∶200。牙齦切片經(jīng)過(guò)檸檬酸液修復(fù)、Ⅱ抗血清封閉，Ⅰ抗孵育，避光條件下Ⅱ抗孵育熒光染色后，立即在熒光顯微鏡下觀察。免疫熒光陽(yáng)性信號(hào)tryptase表達(dá)為綠色熒光，TIM-1表達(dá)為紅色熒光，定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞漿，同一視野tryptase與TIM-1重疊后為橘黃色熒光。染色切片由2名病理醫(yī)師于熒光顯微鏡下觀察tryptase和TIM-1雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞，并計(jì)數(shù)，通過(guò)測(cè)量切片組織的面積，獲得每平方毫米的細(xì)胞個(gè)數(shù)(cells/mm2)，取其平均值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±SD) 表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。不同組間的牙齦組織病理學(xué)觀察數(shù)據(jù)使用多個(gè)獨(dú)立樣本比較的Kruska-Wallis檢驗(yàn)分析，多組間每平方毫米tryptase和TIM-1雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞數(shù)的比較采用多個(gè)獨(dú)立樣本兩兩比較的Nemenyi檢驗(yàn)。以P<0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 組織學(xué)觀察

正常對(duì)照組，未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A1、A2)；輕度牙周炎組，可見(jiàn)少量散在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B1、B2)；重度牙周炎組，出現(xiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并見(jiàn)淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞(圖1C1、C2)。各組牙齦組織炎癥程度評(píng)分見(jiàn)圖2，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比較，輕度和重度牙周炎組的炎癥程度評(píng)分顯著升高(P<0.05)；重度牙周炎組的炎癥程度評(píng)分明顯高于輕度牙周炎組(P<0.05)。

Figure 2. Scoring of inflammation in gingival tissues. A: healthy control group (n=27); B: mild periodontitis group (n=34); C: severe periodontitis group (n=31). Mean±SD. *P<0.05 vs A; #P<0.05 vs B.

2 Tryptase和TIM-1雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞免疫熒光雙染色結(jié)果

各組牙齦組織tryptase和TIM-1雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞免疫熒光雙染色結(jié)果見(jiàn)圖3。在正常對(duì)照組，牙齦組織tryptase和TIM-1雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞數(shù)量較少，表達(dá)較弱，且無(wú)明顯的脫顆粒現(xiàn)象；在輕度牙周炎組，牙齦組織中tryptase和TIM-1雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞數(shù)量增加；在重度牙周炎組，牙齦組織中出現(xiàn)大量tryptase和TIM-1雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞，肥大細(xì)胞有明顯的脫顆?，F(xiàn)象。各組牙齦組織中tryptase和TIM-1雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞密度見(jiàn)圖4，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，輕度慢性牙周炎組(P<0.05)和重度慢性牙周炎組(P<0.01)牙齦組織tryptase和TIM-1雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞數(shù)量明顯升高；重度牙周炎組tryptase和TIM-1雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞個(gè)數(shù)顯著高于輕度牙周炎組(P<0.05)。

Figure 3. Representative photomicrographs of mast cell infiltration with tryptase-TIM-1 immunofluorescence double-staining(×1000).A: healthy control group; B: mild periodontitis group; C: severe periodontitis group.

Figure 4. Tryptase and TIM-1 double-positive mast cells in periodontal tissues of different groups. A: healthy control group (n=27); B: mild periodontitis group (n=34); C: severe periodontitis group (n=31). Mean±SD. *P<0.05,**P<0.01 vs A; #P<0.05 vs B.

討 論

TIM家族是T細(xì)胞表面的跨膜蛋白家族。研究表明，TIM-1和TIM-3是TIM家族中的2個(gè)重要成員，分別在分化成熟的Th2細(xì)胞和Th1細(xì)胞上表達(dá)，參與Th細(xì)胞免疫反應(yīng)的調(diào)控。TIM-1可增強(qiáng)Th2細(xì)胞的活化，TIM-3可下調(diào)Th1細(xì)胞的免疫功能[8]。TIM-1最初被確認(rèn)為甲型肝炎病毒細(xì)胞受體1(hepatitis A virus cellular receptor 1,HAVCR1)，后來(lái)被稱(chēng)為腎臟損傷分子1(kidney injury molecule 1，KIM-1)，是哮喘和過(guò)敏的重要易感性基因，在Th2細(xì)胞上強(qiáng)表達(dá)，在T細(xì)胞活化中作為協(xié)同刺激分子調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答[9-10]。

研究顯示TIM-1在肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞表面均有表達(dá)[1,11]，影響白細(xì)胞介素4(interleukin 4，IL-4)、IL-10、IL-17、干擾素 γ(interferon γ，IFN-γ)等的釋放[12]。TIM-4是TIM-1的配體之一，TIM-1與TIM-4的相互作用調(diào)節(jié)Th細(xì)胞免疫應(yīng)答及平衡Th1/Th2細(xì)胞因子[13]。T細(xì)胞活化早期，在T細(xì)胞抗原受體(T-cell receptor，TCR)刺激下，TIM-1表達(dá)增加，與其配體結(jié)合，刺激抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cells，APCs)表達(dá)，為T(mén)細(xì)胞增殖提供正向的共刺激信號(hào)，同時(shí)APCs上TIM-1的表達(dá)可以直接對(duì)APCs傳遞正向信號(hào)，進(jìn)而增強(qiáng)T細(xì)胞的活化[12,14]。臨床研究表明，甲型肝炎病毒(hepatitis A virus, HAV)感染患者罹患哮喘和過(guò)敏性鼻炎的風(fēng)險(xiǎn)下降，提示TIM-1可能直接調(diào)節(jié)Th2介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，表達(dá)在Th2細(xì)胞表面的TIM-1與HAV結(jié)合直接改變T細(xì)胞的分化及調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞之間的平衡[9]。實(shí)驗(yàn)顯示，使用TIM-1單克隆抗體可以減少過(guò)敏原誘導(dǎo)的呼吸道炎癥[5]，阻斷TIM-1與配體間的相互作用可以為T(mén)h2介導(dǎo)的免疫應(yīng)答及過(guò)敏性哮喘提供有效抗炎治療[12]。然而，TIM-1抗體在識(shí)別TIM-1的不同基因結(jié)構(gòu)時(shí)，對(duì)Th1和Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生及呼吸道炎癥會(huì)出現(xiàn)明顯的雙重性作用。哮喘動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：TIM-1單克隆抗體在識(shí)別黏蛋白的外顯子4時(shí)，可以加重呼吸道炎癥及Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生；當(dāng)抗體與TIM-1的IgV蛋白反應(yīng)時(shí)則阻斷炎癥反應(yīng)[5]。研究表明，小鼠肥大細(xì)胞能夠表達(dá)TIM-1，經(jīng)IgE抗原刺激，腹腔肥大細(xì)胞或骨髓來(lái)源培養(yǎng)的肥大細(xì)胞TIM-1表達(dá)下調(diào)。使用重組小鼠TIM-4(rmTim-4)，能促進(jìn)骨髓的肥大細(xì)胞Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-6和IL-13的產(chǎn)生[1, 15]，提示TIM-1可通過(guò)調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞的作用而影響T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。

牙周病是由菌斑生物引起的牙周支持組織的感染性疾病，導(dǎo)致牙周支持組織的破壞。目前認(rèn)為由細(xì)菌激發(fā)的宿主免疫和炎癥反應(yīng)造成的牙周組織破壞遠(yuǎn)大于細(xì)菌對(duì)牙周組織的直接破壞作用[16-17]。研究顯示，牙周病免疫機(jī)制與T細(xì)胞，尤其是Th1/Th2細(xì)胞之間的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，但關(guān)于牙周病Th1與Th2細(xì)胞作用的精確機(jī)制尚未闡明。研究發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞能夠分泌Th1型和Th2型細(xì)胞因子，影響T細(xì)胞的分化[18]。肥大細(xì)胞作為機(jī)體固有免疫細(xì)胞之一，參與黏膜炎癥、機(jī)體防御和組織修復(fù)等；活化的T細(xì)胞能夠激活肥大細(xì)胞脫顆粒釋放一系列介質(zhì)，包括組胺、白細(xì)胞三烯、血小板激活因子、蛋白酶和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等[2,19]，引起牙周組織的破壞和牙槽骨的吸收[2, 20]。人肥大細(xì)胞根據(jù)其分泌的蛋白酶不同分為2類(lèi)，一類(lèi)是只能分泌tryptase的肥大細(xì)胞；另一類(lèi)是能分泌tryptase、類(lèi)糜蛋白酶(chymase)和羧肽酶(carboxypeptidase)的肥大細(xì)胞[21]。Tryptase為絲氨酸蛋白酶類(lèi)，對(duì)中性粒細(xì)胞具有化學(xué)引誘作用，可以刺激上皮細(xì)胞增殖、分泌IL-8，刺激外周感覺(jué)神經(jīng)分泌炎性神經(jīng)肽誘導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥[2]。

本研究觀察到，tryptase陽(yáng)性肥大細(xì)胞的表達(dá)量隨慢性牙周炎炎癥程度的增加而升高，慢性牙周炎中肥大細(xì)胞有明顯的脫顆?，F(xiàn)象，我們的結(jié)果提示肥大細(xì)胞可能通過(guò)分泌細(xì)胞因子參與慢性牙周炎的防御和破壞機(jī)制，這一結(jié)果與Batista等[2]及Huang等[3]研究結(jié)果相一致。本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光雙染色法首次證實(shí)了人慢性牙周炎牙齦組織的肥大細(xì)胞表達(dá)TIM-1，實(shí)驗(yàn)觀察到tryptase 和TIM-1雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞在正常對(duì)照組、輕度牙周炎組、重度牙周炎組中的表達(dá)逐漸增加，重度牙周炎組織中tryptase 和TIM-1雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞顯著高于輕度牙周炎組，提示肥大細(xì)胞上TIM-1的表達(dá)可能影響肥大細(xì)胞在慢性牙周炎的免疫調(diào)節(jié)作用。牙周炎是僅次于齲病的口腔常見(jiàn)疾病之一，與全身系統(tǒng)性疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和糖尿病等密切相關(guān)，tryptase 和TIM-1雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞在牙周炎的免疫機(jī)制中的作用還有待研究，但TIM-1對(duì)炎癥的雙重性作用，可能為控制牙周炎甚至治療其全身伴發(fā)疾病提供一個(gè)新的方向。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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