水通道蛋白4在大鼠淋巴性腦水腫中的作用

鄭延紅， 楊娜娜， 夏作理

(1兵器工業(yè)北京北方醫(yī)院，北京 100089； 2泰山醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)研究所，山東 泰安 271000)

水通道蛋白 4(aquaporin 4，AQP4)在哺乳動物腦內(nèi)廣泛分布，主要存在于與血腦屏障相關(guān)的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其相連的膠質(zhì)細(xì)胞，其次是腦室室管膜上皮細(xì)胞、腦室脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞和下丘腦神經(jīng)元[1]，腦干神經(jīng)核團(tuán)和大腦皮質(zhì)部分神經(jīng)元也有分布，其表達(dá)遠(yuǎn)比AQP1和AQP9表達(dá)豐富，并且其高度快速轉(zhuǎn)運(yùn)水的能力比其它的水通道蛋白對水的通透性高3～4倍，在腦內(nèi)擔(dān)負(fù)著水代謝平衡的調(diào)節(jié)和神經(jīng)興奮性的保持作用[2]。AQP4不僅參與了細(xì)菌性腦膜炎和腦缺血早期、腦出血及腦創(chuàng)傷后等的細(xì)胞毒性腦水腫的形成[3]，而且加快腦腫瘤、腦出血、創(chuàng)傷等形成的血管性腦水腫的消散[4]。然而，在淋巴性腦水腫(lymphatic brain edema，LBE)形成和消散機(jī)制中，AQP4的地位尚不明確。為此，本實(shí)驗?zāi)康闹荚谘芯縇BE腦含水量與AQP4表達(dá)的關(guān)系，以明確AQP4在LBE中的作用。

材 料 和 方 法

1 動物及分組

選用健康、雄性Sprague-Dawley大鼠(山東大學(xué)動物實(shí)驗中心提供)，體質(zhì)量(246±44)g，平均268 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)和淋巴性腦水腫組(LBE組)。各取90只大鼠分別制作LBE動物模型和假手術(shù)，每組于相應(yīng)手術(shù)后第1、3、7、11及15天取大腦皮質(zhì)，分別進(jìn)行腦含水量、AQP4免疫熒光組織化學(xué)及免疫印跡蛋白表達(dá)的檢測。

2 動物模型及標(biāo)本的制備

2.1動物模型的制備 按照改良的Casley-Smith方法[5]，以鹽酸氯胺酮50 mg/kg和地西泮5 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。固定后，頸部手術(shù)區(qū)剪毛，常規(guī)消毒、切開皮膚，分離皮膚及皮下組織，分別暴露雙側(cè)頸淺、頸深淋巴結(jié)及相應(yīng)淋巴管，結(jié)扎淋巴管并摘除淋巴結(jié)，然后逐層縫合。模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后出現(xiàn)明顯的行為改變，頸部切口無滲出、腫脹及感染，顯微鏡下有典型的腦水腫征象為模型制作成功。假手術(shù)組步驟同模型組，但不結(jié)扎淋巴管，亦不摘除相應(yīng)的淋巴結(jié)。

2.2標(biāo)本的制備 每個時點(diǎn)各取6只大鼠，深麻醉大鼠，0.1 mol/L PBS (pH 7.4) 經(jīng)心灌注，然后斷頭處死，冷環(huán)境條件下迅速取腦，分取右側(cè)大腦皮層組織120 mg左右稱重，進(jìn)行腦含水量測定。左側(cè)大腦皮層組織留取標(biāo)本，進(jìn)行免疫印跡蛋白表達(dá)的檢測。另各取3只大鼠，先用37 ℃肝素化生理鹽水(含肝素5 000 IU)100 mL沖凈血液，然后緩慢灌注4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(4 ℃ pH 7.4)300～400 mL，開顱取大腦皮層組織，后固定24 h。放入20%、30%蔗糖梯度脫水，待腦組織下沉后，-20 ℃ 低溫冠狀面冰凍切片備用。每10張取2張，片厚6 μm，取2套切片，1套行AQP4免疫熒光組織化學(xué)染色，另1套作為陰性對照。

3 主要方法

3.1腦含水量測定 按干-濕重法測定大腦皮層組織含水量：將取出的大腦皮層組織標(biāo)本，迅速稱濕重，然后放置于高溫干燥箱內(nèi)，105 ℃，干燥48 h后，稱量得到干重。腦組織腦含水量按Elliott公式計算：腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

3.2免疫熒光組織化學(xué)染色法 切片放入0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2～7.4)漂洗3次，每次5 min。漂洗后放入10%羊血清中，37℃孵育1 h。將切片放入稀釋后的兔抗大鼠AQP4Ⅰ抗(1∶100，Santa Cruz)中，移入4 ℃冰箱孵育過夜。PBS漂洗3次，每次5 min，切片滴加熒光素FITC標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗(1∶100，Santa Cruz)，37℃孵育1 h。PBS漂洗3次，每次5 min。封片，應(yīng)用Radiance 2100 型熒光掃描共聚焦顯微鏡觀察，Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)分析熒光強(qiáng)度值。每個標(biāo)本染3張切片，每張隨機(jī)取5個視野(×400倍)的圖像。陰性對照不加AQP4Ⅰ抗，代之以PBS。結(jié)果判定：AQP4陽性表達(dá)為胞膜及胞漿內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光信號。隨機(jī)選取5個視野的圖像，應(yīng)用Image-Pro Plus軟件計數(shù)熒光陽性表達(dá)數(shù)，并計算每只大鼠的平均熒光強(qiáng)度。

3.3Western blotting 按照RIPA試劑盒快速提取蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，10% Tris-glycine SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上，Western blotting 封閉液室溫封閉1 h; 加兔抗大鼠AQP4(1∶1 000，Santa Cruz)，4 ℃過夜；加堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2 500，Sigma)，室溫孵育2 h，BCIP/NBT顯色，使用Quantity One 軟件進(jìn)行半定量分析，結(jié)果以目的蛋白和β-actin 吸光度的比值表示。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腦含水量的變化

在LBE組，大鼠大腦皮質(zhì)含水量呈先增加后降低的趨勢，術(shù)后第3天開始上升(P<0.05)，第7天達(dá)到峰值(P<0.01)，第15天仍高于假手術(shù)組水平(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. Changes of the cerebral cortex water content in rats with LBE. Mean±SD.n=6. *P<0.05,**P<0.01 vs sham.

2 AQP4免疫熒光組織化學(xué)表達(dá)的變化

Sham組大鼠的大腦皮質(zhì)可見AQP4免疫熒光染色陽性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞足突及血管周圍少量分布，LBE后3 d即見陽性細(xì)胞數(shù)目增多，免疫熒光染色強(qiáng)度增高(P<0.05)，至7 d陽性細(xì)胞數(shù)目最多，且染色強(qiáng)度最高(P<0.01)，以后逐漸減少，15 d未恢復(fù)至正常，見圖2。

Figure 2. Laser confocal microscopy of AQP4-immunofluorescence,intensity and cell number in cerebral cortex of rats with LBE. Scale bar=50 μm.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs sham.

3 AQP4蛋白表達(dá)的變化

Sham組大鼠的大腦皮質(zhì)可見AQP4蛋白微弱表達(dá)，LBE后3 d AQP4表達(dá)增加(P<0.05)，7 d達(dá)到峰值(P<0.01)，15 d仍高于假手術(shù)組水平(P<0.05)，見圖3。

4 淋巴性腦水腫大腦皮質(zhì)含水量與AQP4蛋白表達(dá)的相關(guān)性

大腦皮質(zhì)含水量和AQP4蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.8024，P<0.05)。

討 論

腦水腫是指腦組織含水量增加引起腦容積的擴(kuò)張，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)對各種原因的腦損害產(chǎn)生的一種組織病理反應(yīng)，是各種腦部疾病的嚴(yán)重并發(fā)癥。

Figure 3. Changes of AQP4 expression in cerebral cortex in rats with LBE (Western blotting). Mean±SD. n=6.*P<0.05,**P<0.01 vs sham.

按其發(fā)生機(jī)制又分為細(xì)胞毒性水腫和血管源性水腫[6]，主要與細(xì)胞膜能量代謝障礙、腦微循環(huán)障礙及血腦屏障(blood brain barrier，BBB)、自由基、鈣超載、興奮性氨基酸的毒性作用、一氧化氮、內(nèi)皮素等因素有關(guān)[7]，但確切機(jī)制尚不明確。近年來隨著分子的研究深入，AQP4日益成為腦水腫研究的熱點(diǎn)。AQP4 主要存在于腦星形膠質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、室管膜上皮細(xì)胞、鄰近軟腦膜的膠質(zhì)細(xì)胞及脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞中，覆蓋超過95%的腦毛細(xì)血管表面[8]，并且AQP4 在大腦的大量分布，以及在星形膠質(zhì)細(xì)胞上的分布呈明顯的極性，即在靠近血管內(nèi)皮細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞終足上大量表達(dá)[9]，因而成為膠質(zhì)細(xì)胞與腦脊液及血管之間水轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在維持腦內(nèi)水平衡中發(fā)揮重要作用。

組織病理及超微結(jié)構(gòu)觀察顯示[10],LBE時腦組織明顯水腫，并有紅細(xì)胞溢出以及吞噬細(xì)胞浸潤，腦的小動脈外膜出現(xiàn)半月形或不規(guī)則形間隙，其間充滿水腫液，形成腦間質(zhì)水腫，為血管源性水腫。同時，水腫區(qū)腦組織出現(xiàn)慢性進(jìn)行性缺血、缺氧及酸中毒等病理過程，進(jìn)而使細(xì)胞間正常的物質(zhì)及信號傳遞障礙，細(xì)胞代射紊亂，神經(jīng)細(xì)胞膜ATP合成減少，鈉鉀泵失調(diào)使細(xì)胞內(nèi)高滲，細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓變化可能通過上調(diào)AQP4 表達(dá)加速水分流入，形成細(xì)胞毒性腦水腫[11]。最終形成血管源性水腫和細(xì)胞毒性水腫并存的混合性水腫，許多情況下難于明確區(qū)分。

本實(shí)驗中，與sham組相比，LBE模型大鼠大腦皮質(zhì)AQP4免疫熒光及蛋白的表達(dá)水平明顯增加，均以術(shù)后7 d水平最高，后逐漸降低，15 d時仍高于sham組，腦含水量的變化趨勢與之相一致，且腦含水量與AQP4蛋白表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，提示AQP4參與腦水腫時腦組織水分布的變化，同時AQP4介導(dǎo)的跨細(xì)胞膜水的轉(zhuǎn)移為血管性腦水腫液體清除的關(guān)鍵[12]。LBE時乳酸中毒、鈉鉀泵和鈣失衡以及滲透壓變化為細(xì)胞性水腫的主要原因[13]，AQP4為水跨星形膠質(zhì)細(xì)胞運(yùn)輸?shù)闹饕方?jīng)，通過AQP4參與水大量而快速通過細(xì)胞膜，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元腫脹[9]和BBB的破壞。我們推斷，缺血缺氧能夠誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4蛋白活性部分得到激活，水大量而快速通過細(xì)胞膜，以降低細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓梯度，使?jié)B透性物質(zhì)進(jìn)一步流入膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞體積的增大，AQP4在促進(jìn)水分進(jìn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞中起著重要作用[14]，因此早期AQP4表達(dá)增高是膠質(zhì)細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)。血管源性腦水腫的水腫液清除主要通過細(xì)胞外間隙和膠質(zhì)細(xì)胞界膜至腦室和蛛網(wǎng)膜下腔，另外還通過膠質(zhì)細(xì)胞終足和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞入血[15]，而AQP4正是在大腦這些區(qū)域大量表達(dá)，AQP4 的開放和表達(dá)升高有利于加速水腫的消退，可在一定程度減輕血管源性腦水腫。由于LBE為細(xì)胞性和血管源性水腫共同存在，因此AQP4的表達(dá)升高，不僅參與了腦水腫的形成，也有助于LBE的吸收與恢復(fù)。

我們推測，LBE后出現(xiàn)能量代謝障礙，初期細(xì)胞缺氧引起細(xì)胞毒性水腫，隨之而來的是血管源性水腫，并且在7 d達(dá)到高峰，以后逐漸減輕。細(xì)胞毒性水腫階段AQP4逐漸升高，說明腦水腫越重，神經(jīng)元的破壞越明顯，血管性水腫時AQP4顯著表達(dá)，以加快腦水腫的清除。AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)水的運(yùn)輸，跨過BBB交界面對水分子的流向起著雙向調(diào)節(jié)作用[1]，因此AQP4在LBE后腦水腫的形成和消除中發(fā)揮了重要的作用。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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