李慧，彭利靜，劉薇，葉明霞，拓步雄

論著·基礎(chǔ)

巴馬司他對(duì)高血壓小鼠模型血壓及血清基質(zhì)金屬 蛋白酶9水平的影響

李慧，彭利靜，劉薇，葉明霞，拓步雄

目的探討外源性基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)抑制劑巴馬司他對(duì)高血壓小鼠血壓及其血清中MMP-9水平和活性的影響。方法將36只高血壓小鼠(高血壓組)平均分為3個(gè)亞組，每組12只，連續(xù)3 d分別以巴馬司他30 mg/kg(高劑量亞組)、10 mg/kg(低劑量亞組)和生理鹽水(對(duì)照亞組)對(duì)小鼠腹腔進(jìn)行注射，依次在最后1次注射后0 h、2 h、4 h、6 h對(duì)各組小鼠血清中MMP-9及其mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)；應(yīng)用明膠酶譜法檢測(cè)各組小鼠血清中MMP-9活性。選擇健康小鼠36只為健康對(duì)照組，檢測(cè)血清MMP-9、mRNA水平，并與高血壓組比較。結(jié)果(1)血壓變化：與健康對(duì)照組比較，高血壓組用藥前血壓較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，用藥后，與對(duì)照亞組及低劑量亞組比較，高劑量亞組血壓降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)血清MMP-9濃度：與健康對(duì)照組比較，用藥前高血壓組MMP-9蛋白濃度顯著高 (P<0.01)，用藥后，組內(nèi)比較：高劑量亞組和低劑量亞組小鼠血清中MMP-9蛋白表達(dá)水平均隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；與低劑量亞組、對(duì)照亞組比較，高劑量亞組在2 h、4 h、6 h血清MMP-9濃度均較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；低劑量亞組與對(duì)照亞組比較，2 h、4 h、6 h差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(3)MMP-9 mRNA表達(dá)：與健康對(duì)照組比較，高血壓組MMP-9 mRNA水平顯著升高 (P<0.05)；用藥后，高劑量亞組和低劑量亞組小鼠血清中MMP-9 mRNA水平均隨著藥物作用時(shí)間的增加而降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；對(duì)照亞組、低劑量亞組、高劑量亞組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。(4)MMP-9活性測(cè)定：隨著巴馬司他給藥劑量的增加，Pro-MMP-9和Active-MMP-9活性呈減弱趨勢(shì)。結(jié)論巴馬司他能夠降低高血壓小鼠血壓水平及其血清中MMP-9水平和活性。

巴馬司他；基質(zhì)金屬蛋白酶9；高血壓；小鼠

近年來(lái)，隨著人們生活習(xí)慣的改變，肥胖人群的數(shù)量日益增多，同時(shí)也使得高血壓的患病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。高血壓是一種常見(jiàn)的慢性非傳染性疾病，心肌梗死、腦卒中、慢性腎臟病及心力衰竭是其主要并發(fā)癥，其中原發(fā)性高血壓還被認(rèn)為是一種多因素疾病，盡管一些新的治療策略能有效地降低血壓，但由高血壓誘導(dǎo)的腎衰竭或損傷的發(fā)病率和病死率并沒(méi)有降低[2,3]。此外，高血壓的發(fā)病人群趨于年輕化，中青年患病率逐年上升。研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)在維持組織的完整性方面具有關(guān)鍵作用，其中基質(zhì)金屬蛋白酶/組織金屬蛋白酶抑制劑系統(tǒng)(matrix metalloproteinases/tissue inhibitors of metalloproteinases，MMPs/TIMPs)參與并調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的代謝[4]。近年來(lái)隨著對(duì)MMPs/TIMP研究的日益深入，其在高血壓方面的作用也越來(lái)越受到關(guān)注。Huang等[5]研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrix metallopeptidase-3, MMP-3)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallopeptidase-9, MMP-9)基因變異能夠通過(guò)影響動(dòng)脈硬化程度和血管內(nèi)皮功能來(lái)促進(jìn)單純收縮期高血壓的進(jìn)展。此外，MMP-9可能在高血壓血管重構(gòu)的早期階段起著關(guān)鍵作用[6]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)外源性MMP-9抑制劑巴馬司他(BB-94)可以減少M(fèi)MP-9介導(dǎo)的血管功能障礙[7]。因此，本研究著重探討了巴馬司他對(duì)高血壓小鼠及其血清中MMP-9水平和活性的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 高血壓小鼠和健康小鼠各36只，分別為高血壓組、健康對(duì)照組，均為BALB/c品系，清潔級(jí)，6～8周齡，平均體質(zhì)量為(24.1±1.3)g，均購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院高血壓研究所。主要試劑與儀器：巴馬司他(batimastat)購(gòu)自武漢金諾化工有限公司；MMP-9酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司；明膠酶譜試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；TRIZOL試劑購(gòu)自Invitrogen公司；Realtime PCR Master Mix(SYBR Green)購(gòu)自Applied Biosystems公司；Bio-TekELX-800酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BIO-TEK公司；Softron BP-98A智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)購(gòu)自北京軟隆科技有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 血壓測(cè)定： 實(shí)驗(yàn)前，所有小鼠在良好舒適的環(huán)境中飼養(yǎng)1周。采用以尾壓法[8](Tail-cuff法)為測(cè)量方式的Softron BP-98A智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)(測(cè)壓范圍350 mm Hg以下)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠血壓水平進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 藥物干預(yù)： 將36只高血壓小鼠隨機(jī)分為3個(gè)亞組(每組12只)：高劑量亞組、低劑量亞組及對(duì)照亞組，連續(xù)3 d分別于小鼠腹腔注射巴馬司他：30 mg/kg、10 mg/kg、0 mg/kg(生理鹽水0.2 ml)[9]。

1.3 觀測(cè)項(xiàng)目

1.3.1 MMP-9濃度： 最后1次注射給藥后，分別于0 h、2 h、4 h、6 h采集小鼠尾靜脈血200 μl，采用ELISA試劑盒測(cè)定，根據(jù)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用Bio-TekELX-800酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值(A)，計(jì)算樣品濃度。

1.3.2 MMP-9 mRNA表達(dá)： 按照說(shuō)明書(shū)提取血白細(xì)胞中的總RNA。采用Realtime PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。MMP-9以及內(nèi)參β-actin引物序列通過(guò)Genefisher軟件設(shè)計(jì)，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。小鼠MMP-9基因上游引物序列為：5’-ACAGCCAACTATGACCAG-3’，下游引物序列為：5’-TGCCACCAGGAACAGG-3’；內(nèi)參β-actin的上游引物序列為5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’，下游引物序列為5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性36 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)40次。

1.3.3 MMP-9活性測(cè)定： 電泳結(jié)束后：(1)將凝膠置于洗脫液中振蕩洗脫2次，每次40 min；(2)將凝膠用漂洗液漂洗2次，每次20 min；(3)將凝膠置于孵育液中37℃孵育42 h。孵育結(jié)束后，經(jīng)染色液染色3 h及脫色液脫色后，顯示出Pro-MMP-9(92 k)和Active-MMP-9(82 k)為位于藍(lán)色背景上的透亮帶，掃描成像并以反轉(zhuǎn)模式打印。

表2 各組小鼠不同時(shí)點(diǎn)血清MMP-9濃度

注：與健康對(duì)照組比較，aP<0.01；與本組0 h比較，bP<0.05，cP<0.01；與本組2 h比較，dP<0.05，eP<0.01；與本組4 h比較，fP<0.05；與對(duì)照亞組比較，gP<0.05，hP<0.01；與低劑量亞組比較，iP<0.05，jP<0.01

表3 各組小鼠不同時(shí)點(diǎn)血清MMP-9 mRNA表達(dá)

注：與健康對(duì)照組比較，aP<0.01；與本組0 h比較，bP<0.05；與本組2 h比較，cP<0.05；與本組4 h比較，dP<0.05；與對(duì)照亞組比較，eP<0.05，fP<0.01；與低劑量亞組比較，gP<0.05

2 結(jié) 果

2.1 小鼠血壓變化 高血壓組的收縮壓和舒張壓水平比健康對(duì)照組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。小鼠腹腔注射不同劑量巴馬司他后，高劑量亞組小鼠血壓水平趨于恢復(fù)正常，與健康對(duì)照組比較，平均收縮壓和舒張壓差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低劑量亞組與對(duì)照亞組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高劑量亞組與對(duì)照亞組及低劑量亞組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；結(jié)果表明，高劑量巴馬司他能夠改善高血壓小鼠的血壓水平。見(jiàn)表1。

表1 小鼠藥物干預(yù)前后血壓變化

注：與健康對(duì)照組比較，aP<0.05；與對(duì)照亞組比較，bP<0.05；與低劑量亞組比較，cP<0.05

2.2 小鼠血清MMP-9測(cè)定

2.2.1 MMP-9濃度： MMP-9蛋白濃度在高血壓組小鼠血清中的水平顯著高于健康對(duì)照組小鼠(P<0.01)。(1)組內(nèi)比較：高劑量亞組和低劑量亞組小鼠血清中MMP-9蛋白表達(dá)水平均隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，不同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；而對(duì)照亞組無(wú)明顯變化(P>0.05)。(2)組間比較：與低劑量亞組、對(duì)照亞組比較，高劑量亞組小鼠血清中MMP-9濃度在2 h、4 h、6 h時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；低劑量亞組與對(duì)照亞組比較，各時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.2.2 MMP-9 mRNA表達(dá)： 與健康對(duì)照組比較，高血壓組MMP-9 mRNA水平顯著升高(P<0.05)。(1)組內(nèi)比較：高劑量亞組和低劑量亞組小鼠血清中MMP-9 mRNA水平均隨著藥物作用時(shí)間的增加而降低，不同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；而對(duì)照亞組無(wú)明顯變化(P>0.05)。(2)組間比較：巴馬司他降低高血壓小鼠血清中MMP-9 mRNA的作用高劑量亞組、低劑量亞組、對(duì)照亞組間兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。以上結(jié)果表明，巴馬司他能夠抑制高血壓小鼠血清中MMP-9 mRNA的水平。見(jiàn)表3。

2.2.3 MMP-9活性測(cè)定： 隨著巴馬司他給藥劑量的增加，Pro-MMP-9和Active-MMP-9活性呈減弱趨勢(shì)。表明巴馬司他能夠抑制高血壓小鼠血清中MMP-9的活性。見(jiàn)圖1。

注：1.健康對(duì)照組；2.對(duì)照亞組；3.低劑量亞組；4.高劑量亞組

3 討 論

近年來(lái)，高血壓的患病率不斷提高，患病人數(shù)不斷增加，嚴(yán)重影響著人類健康。高血壓已成為多種心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，并影響重要臟器如心、腦、腎的功能，最終可導(dǎo)致這些器官的功能衰竭[7]。大多數(shù)高血壓患者沒(méi)有任何癥狀，只有極少一部分患者有頭暈和頭痛的表現(xiàn)，導(dǎo)致了我國(guó)高血壓的低知曉率、低治療率以及低控制率[10]。

巴馬司他是一種廣譜基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，通過(guò)抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)而抑制動(dòng)脈損傷后血管平滑肌細(xì)胞的激活及遷移。目前普遍研究認(rèn)為，長(zhǎng)期高血壓、高血壓心臟病、高血壓腎病、血管重構(gòu)以及動(dòng)脈粥樣硬化，均能夠引起MMPs/TIMPs的失衡[7]。研究發(fā)現(xiàn)，高血壓患者頸動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)MMP-9活性較血壓正常的患者增加，MMP-9在心血管疾病中扮演重要的角色[11]；有研究認(rèn)為血漿TIMP-1水平>1 200 μg/L是高血壓患者發(fā)生充血性心力衰竭的先兆[12]。研究表明，單純收縮期高血壓患者和正常人均可發(fā)生同MMP-9相關(guān)聯(lián)的動(dòng)脈硬化，MMP-9可能參與了動(dòng)脈硬化和單純收縮期高血壓進(jìn)展的過(guò)程[5]。另有研究顯示MMP-9可能在高血壓血管重構(gòu)的早期階段起著關(guān)鍵作用。可見(jiàn)，MMPs/TIMPs失衡在這些疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。

本研究選取自發(fā)性高血壓小鼠模型，探討外源性基質(zhì)金屬蛋白酶9抑制劑巴馬司他對(duì)高血壓小鼠及其血清中MMP-9水平和活性的影響。經(jīng)RT-PCR和ELISA分析，發(fā)現(xiàn)高劑量亞組和低劑量亞組小鼠血清中MMP-9 mRNA及其蛋白表達(dá)水平均隨著藥物作用時(shí)間的增加而降低；高劑量亞組藥物作用6 h后，MMP-9表達(dá)接近正常水平；高劑量亞組和低劑量亞組組間比較，MMP-9表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；表明巴馬司他能夠抑制高血壓小鼠血清中MMP-9的表達(dá)，且具有藥物作用的時(shí)間和劑量依賴性。明膠酶譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，巴馬司他同時(shí)能夠抑制高血壓小鼠血清中MMP-9的活性，可能通過(guò)影響MMP-9分子功能來(lái)抑制MMP-9在高血壓中作用。給藥結(jié)束后血壓測(cè)定發(fā)現(xiàn)，高劑量巴馬司他能夠顯著降低高血壓小鼠的血壓水平；與正常小鼠相比，平均收縮壓和平均舒張壓差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，巴馬司他可能通過(guò)降低高血壓小鼠血清中MMP-9的表達(dá)和活性來(lái)降低小鼠血壓水平，為臨床上巴馬司他降壓作用的研究提供了理論基礎(chǔ)。結(jié)合已有MMPs/TIMPs在高血壓方面的深入研究，可以通過(guò)直接或間接抑制MMP-9，同時(shí)調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs系統(tǒng)來(lái)達(dá)到治療高血壓的目的。

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Effectofbatimastatonhypertensionmiceanditsserummatrixmetalloproteinase9

LIHui,PENGLijing,LIUWei,YEMingxia,TUOBuxiong.

DepartmentofCardiology,the451thHospitalofPeopleLiberationArmy,Xi'an710054,China

TUOBuxiong，E-mail：swattl@126.com

ObjectiveTo study the effect of matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) inhibitor batimastat on blood pressure, serum MMP-9 level and activity in hypertension mice.MethodsThirty-six hypertension (hypertension group) mice were divided into 3 groups, with 12 rats in each group, give 3 days of high dose of batimastat (30 mg/kg, high dose group), low dose of batimastat (10 mg/kg, low dose group) and physiological saline (control group) injection on mouse peritoneal in the three groups respectively, the serum levels of MMP-9 and mRNA levels were detected followed in the 1 last after injection 0 h, 2 h, 4 h, 6 h; serum levels of MMP-9 activity were detected by gelatin zymography assay. Select 36 healthy mice as healthy control group, serum levels of MMP-9 and mRNA levels were detected, and compared with hypertension group.Results(1) Blood pressure change: compared with health control group, hypertension group before treatment blood pressure is higher, the difference was statistically significant (P<0.05), after treatment, compared with the control group and low dose group, high dose group blood pressure decreased, the differences were statistically significant (P<0.05). (2) The serum concentration of MMP-9: compared with health control group, before treatment, in the hypertension group, MMP-9 protein levels were significantly higher (P<0.01), after treatment, the within group comparisons: in high dose group and low dose group, the expression of MMP-9 protein in the serum of mice were decreased along with prolonging the time of drugs, the differences were statistically significant (P<0.05,P<0.01); compared with control group and low dose sub group, high dose group's serum MMP-9 concentration was low at 2 h,4 h,6 h,the differences were statistically significant (P<0.05,P<0.01); compared between low dose group and control group, 2 h, 4 h, 6 h the difference had statistical significance (P<0.05). (3) The expression of MMP-9 mRNA: compared with health control group, hypertension group MMP-9 mRNA was elevated (P<0.05); after treatment, high dose group and low dose group of mice' level of serum MMP-9 mRNA were decreased with the increase of drug action time, differences were statistical significance (P<0.05,P<0.01); paired compassion of low dose sub group, high dose sub group, control sub group showed significant differences (P<0.05,P<0.01). (4) Determination of MMP-9 activity: with the batimastat dose increased, Pro MMP-9 and Active MMP-9 activity decreased.ConclusionBatimastat can reduce blood pressure level and serum MMP-9 level and activity of high blood pressure mice.

Batimastat; Matrix metalloproteinase 9;Hypertension；Mice

710054 西安，解放軍第四五一醫(yī)院心血管內(nèi)科

拓步雄，E-mail：swattl@126.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.07.020

2014-03-21)