郭榮云，聶堯，穆曉清，徐巖，2，肖榮

（1江南大學生物工程學院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2江南大學食品生物技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3羅格斯大學高級生物技術(shù)與醫(yī)學中心，新澤西州 08854，美國）

度洛西汀，化學名(S)-N-甲基-3-(1-萘氧基)-3-(2-噻吩基)-1-丙胺，商品名為Cymbalta，是一種有效抑制5-羥色胺及去甲腎上腺素再攝取抑制劑（SNRI）。臨床上用其鹽酸鹽治療重癥抑郁癥、糖尿病性外周神經(jīng)疼痛及女性應激性尿失禁。在與度洛西汀具有相同化學組成的兩種同分對映異構(gòu)體中，只有(S)-構(gòu)型具有抗抑郁的藥理活性[1]。目前，由于起始原料不同，不對稱合成手性度洛西汀的方法很多[2]。其中，(S)-N,N-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DHTP）是制備度洛西汀的重要手性中間體，因而通過(S)-專一性不對稱還原N,N-二甲基- 3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DKTP）已成為高效制備度洛西汀的一種重要途徑。

微生物法還原羰基化合物以其高效、專一、反應條件溫和、立體選擇性好等優(yōu)點，已成為制備手性醇的重要手段[3-4]。目前，已篩選得到多株能夠不對稱還原制備度洛西汀中間體的微生物，如Exiguobacteriumsp.[5]、Thermoanaerobactersp.[6]、Candida tropicalis[7]、C. viswanathii[8]等。其中C. tropicalis、C. viswanathii能夠全細胞催化DKTP還原生成(S)-DHTP，并獲得＞80%的轉(zhuǎn)化率和高對映體過量值(＞99%)，但反應底物濃度仍較低，反應效率仍較為有限[7-8]。這可能是由于其細胞或胞內(nèi)功能酶的性質(zhì)局限性以及全細胞的細胞膜結(jié)構(gòu)阻礙底物（DKTP）與酶的相互作用，從而影響時空產(chǎn)率[9]，進而大大限制了其工業(yè)應用。而且，目前國內(nèi)度洛西汀手性中間體的研究較少，且水平較低[10]。因此，有必要開發(fā)新型高選擇性的還原酶及其不對稱催化轉(zhuǎn)化的反應體系，以實現(xiàn)(S)- DHTP的高效生物反應制備。

近年來，直接利用已有的數(shù)據(jù)庫進行新型催化劑的開發(fā)已逐漸發(fā)展成為一種實現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化的有效手段[11-12]。在微生物催化立體選擇性氧化還原反應的研究中，C. parapsilosis表現(xiàn)出顯著的催化特性，是比較突出的立體選擇性氧化還原酶酶源[13]，如醛酮還原酶[14]、中鏈脫氫酶[15-16]、短鏈脫氫酶[15]。目前，C. parapsilosis中用于不對稱轉(zhuǎn)化的醛酮還原酶的開發(fā)應用比較有限[17]，因此有必要進一步挖掘新型的醛酮還原酶用于催化DKTP的不對稱轉(zhuǎn)化。本研究利用C. parapsilosis的基因組信息，從C. parapsilosisCCTCCM-203011中得到8個新型的醛酮還原酶，重組表達后，用其構(gòu)建粗酶反應體系，催化還原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DKTP）生成(S)-N,N-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DHTP），見圖1。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Candida parapsilosis CCTCCM 203011菌株來自本實驗室收藏，Escherichia colistrain XL-10 Gold、E. coliBL21 (DE3) 、pET21c質(zhì)粒購于美國Novagen公司，基因操作試劑均購自大連寶生物有限公司。

圖1 粗酶體系催化還原DKTP生成 (S)-DHTP

N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DKTP）、(S)-N,N-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DHTP）均購自浙江九洲藥業(yè)股份有限公司；氨芐青霉素、 IPTG均購自上海生工生物技術(shù)有限公司；輔酶NADPH、NADP+均購自上海索萊寶生物科技有限公司；正己烷（色譜純）、異丙醇（色譜純）均購自Tedia公司；其他分析純試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌株的構(gòu)建和菌體培養(yǎng)

使用在線分析軟件NCBI（http：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）利用C. parapsilosis基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.sanger.ac.uk/sequencing/Candida/ parapsilosis/）在C. parapsilosisCCTCC M203011中挖掘得到8個同源醛酮還原酶序列，見表1[18-19]。設計引物（表1）擴增獲得醛酮還原酶編碼區(qū)基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET21c，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21 (DE3) 感受態(tài)細胞中進行活性表達。

重組大腸桿菌在含50μg/mL氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中于37℃、200r/min 振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.6～0.8，加IPTG至終濃度為0.1mmol/L，于17℃、200r/min 誘導表達12h。

1.2.2 粗酶液的制備

將誘導表達后的發(fā)酵液于8000r/min離心10min收集菌體，用生理鹽水洗滌3次，重懸于0.1mol/L磷酸鉀緩沖液（pH=6.5）中（細胞濃度為100g/L），超聲波破碎細胞。破碎條件：工作時間1s，間隔時間3s，總工作時間5min。4℃的條件下12000r/min 離心15min，收集上清液作為粗酶液用于不對稱催化反應。

1.2.3 酶促不對稱還原DKTP合成 (S)-DHTP

2mL磷酸鉀緩沖液（0.1mol/L，pH=6.5）中含有1mL粗酶液（總蛋白含量5mg）及5g/L DKTP、輔助底物糖（醇）（10g/L）、NADPH（0.1mmol/L）和NADP+（0.1mmol/L），置于30℃、200r/min的搖床中L反應24h。反應結(jié)束后，加入2倍體積乙酸乙酯萃取，有機相用高效液相色譜儀分析產(chǎn)物光學純度及產(chǎn)率。本文中的生物轉(zhuǎn)化試驗均重復3次，然后取其平均值。

1.2.4 產(chǎn)物DHTP的分析

產(chǎn)物分析在Agilent 1200型液相色譜儀上進行，色譜柱為Chiralcel OD-H柱 (4.6mm × 25cm；日本Daicel Chemical公司)，流動相為正己烷∶異丙醇（8∶2，體積比），流速為0.6mL/min，檢測波長為241nm。(R)-DHTP及(S)-DHTP的保留時間分別為15.48min、16.78min，底物DKTP的保留時間為28.27min。

轉(zhuǎn)化率（X）和產(chǎn)物ee值的計算公式如式（1）、式（2）。

表1 基于基因組數(shù)據(jù)庫挖掘得到的潛在醛酮還原酶基因及其引物序列

式中，Co為底物的初始濃度；CP為反應終止時產(chǎn)物的濃度；CS、CR分別為 (S)-DHTP、(R)-DHTP 的濃度。

1.2.5 催化反應條件的優(yōu)化

在1.2.3節(jié)的不對稱反應條件下，在1g/L DKTP時，考察8個醛酮還原酶重組菌不對稱還原 DKTP 的能力，篩選出能夠高立體選擇性催化還原生成光學活性 (S)-DHTP 的優(yōu)良菌株。在此基礎上，在5g/L DKTP時考察了輔底物、輔酶濃度、反應溫度、反應初始pH值、底物濃度對重組大腸桿菌粗酶液反應體系不對稱還原DKTP生成光學活性(S)-DHTP的影響，旨在優(yōu)化催化反應條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 不對稱還原DKTP的新型醛酮還原酶的基因組挖掘

利用C. parapsilosis的基因組信息，通過與conjugated polyketone reductase C1的序列相似性挖掘得到8個醛酮還原酶（CPARs）基因核苷酸編碼序列，這些序列編碼蛋白的一級結(jié)構(gòu)與conjugated polyketone reductase C1具有15%～42%的同源性，說明通過基因組挖掘得到的讀碼框序列編碼新型的潛在醛酮還原酶。利用重組大腸桿菌分別表達8種潛在醛酮還原酶編碼基因，構(gòu)建了醛酮還原酶工具箱。這8株重組大腸桿菌經(jīng)細胞培養(yǎng)、細胞破碎后，進行粗酶催化反應，篩選能夠高立體選擇性不對稱還原 DKTP 生成光學活性的 (S)-DKTP的醛酮還原酶，結(jié)果見表2。酶促不對稱還原DKTP發(fā)現(xiàn)，CPARs 均為NADPH依賴型（結(jié)果未顯示），CPAR4在DKTP 1g/L時，產(chǎn)物ee值大于99%，產(chǎn)率達到 95.2%，具有不對稱還原DKTP生成 (S)-DHTP的立體專一性。

表2 不同醛酮還原酶催化還原 DKTP 的特性對比

2.2 粗酶體系催化還原DKTP生成(S)-DHTP的 研究

目前，醛酮還原酶不對稱催化還原羰基化合物的主要反應類型為全細胞、純酶、粗酶催化。其中，全細胞催化因能利用細胞自生的輔酶代謝途徑進行輔酶再生而備受關注，但全細胞的細胞膜結(jié)構(gòu)阻礙底物（DKTP）與酶的相互作用，從而影響其時空產(chǎn)率[9]，進而大大限制了其工業(yè)應用；純酶催化因具有較高的反應速率和較少的副反應而優(yōu)勢明顯，但酶純化及輔酶添加（或建立輔酶再生體系）會大大提高反應成本；粗酶催化因含有細胞內(nèi)部全部的酶，能夠利用其中自有的酶系統(tǒng)構(gòu)建自組裝的輔酶循環(huán)系統(tǒng)，解決細胞膜對底物（DKTP）的屏障及輔酶循環(huán)問題。因此，本研究采用CPAR4粗酶液構(gòu)建粗酶體系催化還原DKTP生成(S)-DHTP的 研究。

2.2.1 輔助底物對粗酶體系轉(zhuǎn)化反應的影響

由于醛酮還原酶在催化立體選擇性氧化還原反應過程中，需要輔助底物作輔酶循環(huán)系統(tǒng)的供氫體，因此，有必要研究輔助底物對反應的影響。因此本研究選擇多種糖類（蔗糖、葡萄糖、木糖、麥芽糖、果糖、乳糖）和醇類（甘油、乙醇、異丙醇、山梨醇）作為輔助底物進行研究，考察其對轉(zhuǎn)化作用的影響，結(jié)果如表3所示。實驗結(jié)果顯示，多種糖類及醇類能夠作為此自組裝輔酶循環(huán)系統(tǒng)的輔助底物。其中糖類中效果最好的是果糖和乳糖，在四種醇類中效果最好的是乙醇和異丙醇。多種糖類及醇類對反應的促進作用暗示了粗酶體系中存在多種可以用作輔酶循環(huán)的酶類。由于乳糖可被細胞粗酶液中的水解酶類水解為半乳糖和葡萄糖，其在粗酶液中的代謝過程伴隨著輔酶的產(chǎn)生，這可能解釋乳糖對反應具有最佳的促進作用。雖然乙醇、異丙醇對催化反應也具有較佳的促進作用，但其促進作用仍低于乳糖，且醇類化合物的極性大對生物催化劑易產(chǎn)生抑制作用[20]。綜合考慮，本研究選擇乳糖作為輔助底物進行下一步研究。

表3 輔助底物對粗酶體系不對稱還原DKTP的影響

2.2.2 輔酶濃度對粗酶體系轉(zhuǎn)化反應的影響

TTN（total turnover number，TTN）指每摩爾輔酶所能生成的目的產(chǎn)物的摩爾數(shù)，是衡量輔酶利用效率的一個重要指標，以及評價輔酶再生方法是否具備良好再生能力和應用前景的一個重要指標。因此，本研究考察了輔酶NADPH和NADP+濃度對反應的影響，如表4所示。結(jié)果顯示NADP+和NADPH濃度對反應影響基本一致，由于氧化型輔酶NADP+的價格低于還原性輔酶NADPH的價格，NADP+作為輔酶用于反應是一個更為經(jīng)濟的選擇。在底物濃度為5g/L，NADP+濃度為0.01mmol/L時，反應的TTN可達883，但其產(chǎn)率僅有32.4，當NADP+濃度為0.02mmol/L時，反應的TTN為852，產(chǎn)率為62.5%。在兼顧產(chǎn)率及TTN的情況下，NADP+濃度為0.02mmol/L是最適輔酶濃度。

2.2.3 反應溫度對粗酶體系轉(zhuǎn)化反應的影響

由于粗酶體系中細胞內(nèi)部的酶類失去了細胞膜 的保護，對溫度非常敏感。因此有必要研究溫度對粗酶催化的不對稱反應的影響，如圖2所示。研究結(jié)果表明，反應的溫度對產(chǎn)物的產(chǎn)率和光學純度都有一定的影響，在溫度低于30℃時，隨著溫度的升高，產(chǎn)物產(chǎn)率逐漸增大，產(chǎn)物的光學純度保持在99%以上；而當反應溫度高于30℃時，隨著溫度的升高，產(chǎn)物產(chǎn)率和光學純度都減小，一方面由于高溫使酶失活，產(chǎn)率減??；另一方面當反應溫度超過30℃時，可能由于酶立體選擇性的改變導致產(chǎn)物光學純度降低。因此，30℃為反應最適溫度，產(chǎn)物ee值為99%，產(chǎn)物產(chǎn)率可達70.9%。

表4 輔酶濃度對粗酶體系不對稱還原DKTP的影響

圖2 溫度對粗酶體系不對稱還原DKTP的影響

2.2.4 反應pH值對粗酶體系轉(zhuǎn)化反應的影響

在生物催化的反應過程中，反應體系的pH值不僅會影響酶的構(gòu)型、穩(wěn)定性以及活性中心的解離狀態(tài)，還會影響輔酶體系和反應中氫傳遞及電子轉(zhuǎn)移。生物催化體系pH值對DKTP的不對稱還原效率的影響如圖3所示。研究結(jié)果表明，初始pH值小于6時，CPAR4的產(chǎn)率及光學純度受影響較大，隨著pH值的升高，產(chǎn)物產(chǎn)率及光學純度逐漸增大；而pH值大于6時，CPAR4的產(chǎn)率及光學純度受影響較小。因此，pH=6.5為反應最適pH值。

2.2.5 底物濃度對粗酶體系轉(zhuǎn)化反應的影響

圖3 pH值對粗酶體系不對稱還原DKTP的影響

圖 4 底物濃度對粗酶體系不對稱還原DKTP的影響

對于傳統(tǒng)的化學催化劑來說，生物催化劑的主 要劣勢在于較低的底物耐受性。底物濃度對不對稱還原反應催化的影響如圖4所示，在底物濃度小于3g/L時，隨著底物濃度的升高，產(chǎn)率略有下降；當?shù)孜餄舛葹?g/L時，產(chǎn)率依然達到94.5%。繼續(xù)提高底物濃度時，產(chǎn)率有一定的下降。當?shù)孜餄舛葹?g/L 時，產(chǎn)率達到71.2%，且底物濃度進一步增加至6g/L時，產(chǎn)率仍有50%左右。說明底物DKTP本身對粗酶體系有較大影響，且該酶體系對高濃度的DKTP具有一定的耐受性。

3 結(jié) 論

本研究利用C. parapsilosis的基因組信息，挖掘得到8個新型的醛酮還原酶（CPARs）基因，構(gòu)建醛酮還原酶工具箱（重組大腸桿菌分別表達8 種醛酮還原酶）。在構(gòu)建的8株重組菌中，CPAR4能夠高立體選擇性地不對稱還原DKTP得到 (S)-DHTP。為進一步提高底物DKTP的轉(zhuǎn)化率、構(gòu)建CPAR4的粗酶催化反應體系，此反應體系需要乳糖作為輔助底物以及極少量NADP+作為起始輔酶。通過此粗酶反應體系的優(yōu)化，3g/L的DKTP產(chǎn)率達到94.5%，光學純度大于99.9%，這與目前報道的最高水平相當[21]。研究結(jié)果進一步證明，基于基因組信息挖掘，可以有效獲得用于制藥和精細化工行業(yè)的新型高效生物催化劑。此外， 針對生物催化不對稱氧化還原反應的傳質(zhì)、電子傳遞等問題，建立具有自身輔酶再生能力的粗酶催化體系具有一定的應用潛力。

[1] Liu H L，Hoff B H，Anthonsen T. Chemo-enzymatic synthesis of the antidepressant duloxetine and its enantiomer[J].Chirality，2000，12(4)：26-29.

[2] Tang C G，Lin H，Zhang C，et al. Highly enantioselective bioreduction ofN-methyl-3-oxo-3-(thiophen-2-yl) propanamide for the production of (S)-duloxetine[J].Biotechnology Letters，2011，33(7)：1435-1440.

[3] Wohlgemuth R. Asymmetric biocatalysis with microbial enzymes and cells[J].Current Opinion In Microbiology，2010，13(3)：283-292.

[4] Hollmann F，Arends I W C E，Holtmann D. Enzymatic reductions for the chemist[J].Green Chemistry，2011，13(9)：2285-2313.

[5] Wada M，Yoshizumi A，F(xiàn)urukawa Y，et al. Cloning and overexpression of theExiguobacteriumsp. F42 gene encoding a new short chain dehydrogenase，which catalyzes the stereoselective reduction of ethyl 3-oxo-3-(2-thienyl) propanoate to ethyl (S)-3-hydroxy-3-(2-thienyl) propanoate[J].Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2004，68(7)：1481-1488.

[6] Breuer M. Method for production of (1S)-3-chloro-1-(2-thienyl)- propan-1-ol using alcohol dehydrogenase fromthermoanaerobacter：USA，US7785847 B2[P]. 2010-08-31.

[7] Soni P，Banerjee U C. Biotransformations for the production of the chiral drug (S)-duloxetine catalyzed by a novel isolate ofCandida tropicalis[J].Applied Microbiology Biotechnology，2005，67(6)：771-777.

[8] Soni P，Kansal H，Banerjee U C. Optimization of process parameters for the production of carbonyl reductase byCandida viswanathiiin a laboratory-scale fermentor[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2007，35(3)：167-173.

[9] Soni P，Prasad G S，Banerjee U C. Optimization of physicochemical parameters for the enhancement of carbonyl reductase production byCandida viswanathii[J].Bioprocess and Biosystems Engineering，2006，29(3)：149-156.

[10] 沈云霞. 度洛西汀中間體手性醇的生物轉(zhuǎn)化[D]. 揚州：揚州大學，2009.

[11] Zou Z Z，Yu H L，Li C X，et al. A new thermostable β-glucosidase mined from dictyoglomus thermophilum：Properties and performance in octyl glucoside synthesis at high temperatures[J].Bioresource Technology，2012，118：425-430.

[12] Riebel A，de Gonzalo G，F(xiàn)raaije M W. Expanding the biocatalytic toolbox of flavoprotein monooxygenases fromRhodococcus jostiiRHA1[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2013，88：20-25.

[13] Gamenara D，Domínguez de María P.Candidaspp. redox machineries：An ample biocatalytic platform for practical applications and academic insights[J].Biotechnol Advances，2009，27(3)：278-285.

[14] Kataoka M，Delacruz-Hidalgo A R G，Akond M，et al. Gene cloning and overexpression of two conjugated polyketone reductases，novel aldo-keto reductase family enzymes，ofCandida parapsilosis[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2004，64(3)：359-366.

[15] Nie Y，Xiao R，Xu Y，et al. Novel anti-Prelog stereospecific carbonyl reductases fromCandida parapsilosisfor asymmetric reduction of prochiral ketones[J].Organic & Biomolecular Chemistry，2011，9(11)：4070-4078.

[16] Wang S，Xu Y，Zhang R，et al. Improvement of (R)-carbonyl reductase-mediated biosynthesis of (R)-1-phenyl-1,2-ethanediol by a novel dual-cosubstrate-coupled system for NADH recycling[J].Process Biochemistry，2012，47(7)：1060-1065.

[17] Matsuda T，Yamanaka R，Nakamura K. Recent progress in biocatalysis for asymmetric oxidation and reduction[J].Tetrahedron：Asymmetry，2009，20(5)：513-517.

[18] Butler G，Rasmussen M D，Lin M F，et al. Evolution of pathogenicity and sexual reproduction in eightCandidagenomes[J].Nature，2009，459(7247)：657-662.

[19] Wang L J，Li C X，Ni Y，et al. Highly efficient synthesis of chiral alcohols with a novel NADH-dependent reductase fromStreptomyces coelicolor[J].Bioresource Technology，2011，102(14)：7023-7028.

[20] Ou Z M，Wu J P，Yang L R，et al. Asymmetric reduction of chloroacetophenones to produce chiral alcohols with microorganisms[J].Korean Joumal of Chemical Engineering，2008，25(1)：124-128.

[21] Kansal H，Banerjee U C. Enhancing the biocatalytic potential of carbonyl reductase ofCandida viswanathiiusing aqueous-organic solvent system[J].Bioresource Technology，2009，100(3)：1041-1047.