馬向霞，馬志平，侯美羽，蘇艷華

(天津市醫(yī)藥集團技術發(fā)展有限公司，天津 300193)

馬向霞，馬志平，侯美羽，蘇艷華

(天津市醫(yī)藥集團技術發(fā)展有限公司，天津 300193)

目的：建立用HPLC法測定4-硝基苯丙胺鹽酸鹽中有關物質2-硝基苯丙胺鹽酸鹽的方法。方法：采用C18色譜柱，以0.020 mol/L磷酸二氫銨(2%三乙胺，磷酸調pH 4.5)-乙腈(95∶5)為流動相，流速為1.0 ml/min，檢測波長為220 nm，柱溫為30 ℃。結果：2-硝基苯丙胺鹽酸鹽與相鄰雜質峰及主成分分離良好，2-硝基苯丙胺鹽酸鹽在0.496～11.904 μg/ml濃度范圍內與峰面積線性關系良好(r=0.999 8)，定量限為5.0 ng，檢測限為2.5 ng，平均回收率(n=9)為98.3%，RSD為3.5%；結論：該方法適用于4-硝基苯丙胺鹽酸鹽中2-硝基苯丙胺鹽酸鹽的測定，方法簡便，結果準確。

4-硝基苯丙胺，2-硝基苯丙胺，有關物質，高效液相色譜法

隨著藥品研發(fā)要求不斷提高，起始原料中有關物質控制是質量控制的重中之重。4-硝基苯丙胺鹽酸鹽在合成過程中可能引入的主要有關物質為2-硝基苯丙胺鹽酸鹽，其為4-硝基苯丙胺鹽酸鹽的同分異構體，會直接參與后續(xù)反應，含量過高，后續(xù)步驟又不能有效去除，則可能導致成品原料藥質量不合格，所以控制4-硝基苯丙胺鹽酸鹽中2-硝基苯丙胺鹽酸鹽的含量就極為重要。

樣品中異構體含量可采用氣相色譜法進行檢測[1,2]。選擇合適的流動相條件，樣品中同分異構體含量也可采用高效液相色譜法進行檢測[3]。本法建立了4-硝基苯丙胺鹽酸鹽中有關物質2-硝基苯丙胺鹽酸鹽檢測的高效液相色譜法，操作簡便，靈敏度高，重復性好，專屬性強。參照《中國藥典》[4]進行了方法學驗證。該方法適用于4-硝基苯丙胺鹽酸鹽中的有關物質2-硝基苯丙胺鹽酸鹽含量測定。用本方法對3個批次4-硝基苯丙胺鹽酸鹽中2-硝基苯丙胺鹽酸鹽進行檢測，結果表明3批4-硝基苯丙胺鹽酸鹽樣品中2-硝基苯丙胺鹽酸鹽含量均小于1.0%。

1 儀器與試藥

日本島津LC-20AT型高效液相色譜儀(SPD-20A紫外檢測器，島津LC-Solution色譜工作站，日本島津公司)；天平(賽多利斯BT25S和賽多利斯BS110S)。4-硝基苯丙胺鹽酸鹽(蘇州愛瑪特生物科技有限公司，批號131007，純度99.70%)；2-硝基苯丙胺鹽酸鹽(天津市醫(yī)藥集團技術發(fā)展有限公司，批號140505，純度97.9%)；三乙胺為色譜純(天津市科密歐化學試劑有限公司)；乙腈為色譜純(天津市康科德科技有限公司)；娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.020 mol/L磷酸二氫銨(2%三乙胺，磷酸調pH 4.5)-乙腈(95∶5)；流速：1.0 ml/min；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。在上述色譜條件下，4-硝基苯丙胺鹽酸鹽和2-硝基苯丙胺鹽酸鹽理論塔板數分別為8 838和7 613，均大于5 000，符合要求。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取適量2-硝基苯丙胺鹽酸鹽，用流動相溶解并稀釋制成每1 ml含20 μg的溶液，作為對照品貯備液，精密量取5 ml，置10 ml量瓶中，流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取適量4-硝基苯丙胺鹽酸鹽，用流動相溶解并稀釋制成每1 ml含1 mg 4-硝基苯丙胺鹽酸鹽的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對照溶液制備 精密稱取4-硝基苯丙胺鹽酸鹽對照品適量，用流動相溶解并稀釋制成每1 ml含1 mg 4-硝基苯丙胺鹽酸鹽的溶液，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性考查 精密稱取適量4-硝基苯丙胺鹽酸鹽，用流動相溶解并稀釋制成每1 ml含1 mg 4-硝基苯丙胺鹽酸鹽的溶液，注入液相色譜儀，考查2-硝基苯丙胺與相鄰雜質間的分離度。結果2-硝基苯丙胺鹽酸鹽與相鄰雜質最小分離度為2.1，4-硝基苯丙胺鹽酸鹽和2-硝基苯丙胺鹽酸鹽的分離度為12.4，分離度均符合要求。見圖1。

2.4 線性關系考查 精密量取適量“2.2.1”項下的對照品貯備液，用流動相作為溶劑進行不同比例稀釋，制成各級線性對照品溶液，分別精密量取10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標(C)，峰面積為縱坐標(A)進行線性回歸。回歸方程為：A=13 987C-60.5(r=0.999 8)。結果表明，2-硝基苯丙胺鹽酸鹽在0.496～11.904 μg/ml范圍內，線性關系良好。

1. 2-硝基苯丙胺鹽酸鹽 2. 4-硝基苯丙胺鹽酸鹽

2.5 重復性試驗 按照“2.2.2”項下供試品溶液制備方法平行制備6份，按照“2.1”項下的色譜條件分別進樣，外標法以峰面積計算樣品中2-硝基苯丙胺鹽酸鹽的含量，可得出6份供試品溶液中2-硝基苯丙胺鹽酸鹽平均含量為0.20%，RSD為3.80%，結果表明方法重復性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件分別于室溫下0、2、4、8、12和24 h進樣，記錄色譜圖，考查供試品溶液中2-硝基苯丙胺鹽酸鹽含量，24 h內2-硝基苯丙胺鹽酸鹽含量在0.19%～0.21%之間，結果表明供試品溶液室溫下放置24 h內穩(wěn)定。

2.7 定量限與檢測限的測定 將對照品溶液稀釋后進樣，以信噪比10∶1時的進樣量(ng)為定量限，信噪比3∶1時的進樣量(ng)為檢測限，測得2-硝基苯丙胺鹽酸鹽的定量限為5.0 ng，檢測限為2.5 ng。

2.8 回收率試驗 精密稱取約10 mg 4-硝基苯丙胺鹽酸鹽，置10ml量瓶中，稱取9份，分別用“2.2.1”項下對照品貯備液4、5和6 ml各3份，分別置于上述9個10 ml量瓶中，流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得回收率試驗溶液。以“2.5”項下重復性實驗的數據作為加樣前回收率試驗溶液。按“2.1”項下的色譜條件進樣測定，扣除本底后計算2-硝基苯丙胺鹽酸鹽的回收率為98.3%，RSD為3.5%，見表1。

表1 回收率試驗結果

2.9 樣品測定 取3批4-硝基苯丙胺鹽酸鹽，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依“2.1”項下色譜條件進樣測定，外標法以峰面積計算樣品中2-硝基苯丙胺鹽酸鹽的含量，結果見表2。

表2 樣品測定結果

3 討論

3.1 流動相的選擇 經比較，流動相pH大于5.0時，4-硝基苯丙胺鹽酸鹽拖尾因子較大，乙腈比例較大時，不能將4-硝基苯丙胺鹽酸鹽與2-硝基苯丙胺鹽酸鹽分開。加入2%三乙胺能大大改善4-硝基苯丙胺鹽酸鹽的對稱因子，且所選用的流動相能使2-硝基苯丙胺鹽酸鹽與4-硝基苯丙胺鹽酸鹽的分離度達到12.4，最終確定流動相為0.020 mol/L磷酸二氫銨(2%三乙胺，磷酸調pH 4.5)-乙腈(95∶5)。

3.2 批次間雜質含量的差異 企業(yè)不同批次4-硝基苯丙胺鹽酸鹽之間2-硝基苯丙胺鹽酸鹽含量差異較大，考慮到起始原料的質量直接影響藥品中原料藥的質量，故原料藥生產企業(yè)在將4-硝基苯丙胺鹽酸鹽作為起始原料時應考查不同2-硝基苯丙胺鹽酸鹽含量對后續(xù)中間體及成品的影響，從而獲得滿意的原料藥產品。本方法的建立為以4-硝基苯丙胺鹽酸鹽為起始原料的原料藥企業(yè)購買合格的起始原料提供了良好的檢測方法，同時為4-硝基苯丙胺鹽酸鹽生產企業(yè)控制產品中2-硝基苯丙胺鹽酸鹽含量提供了準確的檢測方法。

1 王世玉，劉菲，劉玉龍. 氣相色譜-質譜法檢測地下水中12種壬基酚同分異構體[J]. 分析化學，2013，41(11)：1699-1703

2 林麒，李國波，葛品. 氣相色譜-質譜聯(lián)用法檢測母乳脂肪中反式脂肪酸[J]. 色譜，2016，34(5)：520-527

3 韓明友，申衛(wèi)華，時軍. 反相高效液相色譜法分離和測定硝基苯酚的三種異構體[J]. 分子科學學報，1997，13(4)：247-250

4 中國藥典[S]. 四部.2015：374-377

2016-07-12

R927.2

A

1006-5687(2016)05-0026-03