段寅慧,吳 敏,2*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,南京 210029;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,南京 210029)

糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是由于體內(nèi)胰島素分泌絕對或相對不足而引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂，并有遺傳傾向的疾病，其發(fā)病機制尚不明確。糖尿病屬于中醫(yī)消渴病范疇。國醫(yī)大師周仲瑛教授提出“瘀熱致消”理論[1]，臨床常用鬼箭羽與荔枝核配伍治療糖尿病及其并發(fā)癥，取得一定的療效。本實驗采用果蠅作為實驗動物模型，探討鬼箭羽和荔枝核治療機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性O(shè)regon Red果蠅由中國藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室提供。

1.2 飼料(自配) 正常果蠅食物配方：水1 L，酵母25 g，大豆粉9.18 g，玉米粉67.05 g，蔗糖40 g，麥芽糖42.4 g，瓊脂粉6 g，甲酸甲酯/無水乙醇0.25 mL/2.5 mL、苯甲酸鈉1 g，丙酸6.875 g。高糖食物配方：上述正常果蠅食物配方中，增加20%蔗糖。高脂食物配方：上述正常果蠅食物配方中，增加20%棕櫚酸。

1.3 試劑與設(shè)備 鬼箭羽(產(chǎn)地：湖北；批號：121001)、荔枝核(產(chǎn)地：廣東；批號：111001)均購于南京中醫(yī)藥大學(xué)百草堂中醫(yī)門診部；儀器和設(shè)備由中國藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室提供，試劑購于南京凱基生物公司，葡萄糖檢測試劑盒、三酰甘油檢測試劑盒。

1.4 藥物提取方法 鬼箭羽、荔枝核各20 g混合，70%乙醇400 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,加熱回流提取2 h，2次，50 ℃濃縮至浸膏狀態(tài)，-80 ℃冷凍，冷凍干燥儀干燥至粉狀，密封-20 ℃保存。

1.5 糖尿病果蠅模型的建立 高糖誘導(dǎo)的果蠅糖尿病模型和高脂誘導(dǎo)的果蠅糖尿病模型均設(shè)空白對照組、模型組和給藥組。將3 d雄性果蠅隨機分組,空白對照組的果蠅使用正常的果蠅培養(yǎng)基，將隨機挑選出的高糖誘導(dǎo)的果蠅糖尿病模型喂養(yǎng)高糖果蠅培養(yǎng)基1周后,再隨機分為模型組和給藥組,給藥組喂養(yǎng)加入占食物總重量1%的鬼箭羽和荔枝核提取物的高糖飼料1周(高脂誘導(dǎo)的果蠅糖尿病模型高脂造模方法同高糖造模方法)。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 果蠅進食量測定 根據(jù)鬼箭羽和荔枝核在臨床上的用藥劑量,制定給藥組果蠅飼料的給藥濃度，設(shè)定占食物重量0.2%、1%、5%3個濃度，挑選出跟空白對照組相比進食量差別最小的濃度進行下一步實驗。

1.6.2 果蠅進食量測定方法 將正常果蠅培養(yǎng)基喂養(yǎng)1周的雄性果蠅,饑餓4 h后，隨機分為3個濃度組,0.2%、1%、5%鬼箭羽和荔枝核提取物組，并包含0.8% Blue 9(erioglaucine disodium salt)的正常果蠅食物，進食15 min后，取6只，加入500 μLPBS，高速勻漿后，12 000 r/min離心5 min，吸上清，14 000 r/min離心20 min，取200 μL上清至96孔板，酶標儀分別測定625、675 nm吸光度。

1.6.3 體質(zhì)量 將果蠅麻醉后，稱體質(zhì)量。

1.6.4 海藻糖濃度測定 果蠅循環(huán)體液中主要是海藻糖,測定海藻糖濃度可反映果蠅血糖水平。取4只果蠅，加70%乙醇0.5 mL高速勻漿后，14 000 r/min離心5 min；取上清,45 ℃至真空干燥45 min，冷卻至室溫，取200 μL的2% Na2SO4溶解，100 ℃加熱10 min，至室溫，酶標儀測定620 nm吸光度。

1.6.5 三酰甘油濃度測定 取6只果蠅，放入EP管中，置于冰上，加0.5 mL 0.05% TWEEN-20水溶液，高速勻漿。5 000 r/min離心40 min，取上清5 μL，加入100 μL裂解液、800 μL d2H2O,200 μL的不含甘油的試劑(catalog#500-0006),孵育3 min，酶標儀測定595 nm吸光度。

1.6.6 蛋白濃度測定 取1.6.6剩下的400 μL，70 ℃滅活5 min，與10 μL的10 mg/mL Lipoprotein-Lipase 37 ℃12 h裂解液,5 000 r/min離心1 min，取200 μL移置新的EP 管中，14 000 r/min離心3 min，取50 μL上清至free glycerol reagent (Sigma catalog#F6428)37 ℃中孵育30 min，酶標儀測定540 nm吸光度。

2 結(jié)果

2.1 鬼箭羽配伍荔枝核對高糖誘導(dǎo)的果蠅糖尿病模型海藻糖濃度、三酰甘油濃度、蛋白濃度的影響 模型組與空白對照組相比海藻糖濃度明顯升高，有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);三酰甘油濃度明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；蛋白濃度無顯著差別(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。給藥組與模型組相比海藻糖濃度明顯降低，有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；三酰甘油濃度明顯降低,有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；蛋白濃度無顯著差別(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表1。

組 別海藻糖濃度/(mg/dL)三酰甘油濃度/(μg/mg)蛋白濃度/(mg/mL)空白組39．34±12．20 32．55±3．69 0．44±0．03模型組77．09±20．47△△42．74±2．44△ 0．49±0．03給藥組43．16±5．29##27．70±2．48##0．51±0．04

注：與模型組相比，##P<0.01；與空白組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

2.2 鬼箭羽配伍荔枝核對高脂誘導(dǎo)的果蠅糖尿病模型體質(zhì)量、海藻糖濃度、三酰甘油濃度、蛋白濃度的影響 模型組與空白對照組相比體質(zhì)量無顯著差別(P>0.05)，無統(tǒng)計學(xué)意義；海藻糖濃度明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；三酰甘油濃度明顯升高，有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；蛋白濃度無顯著差別(P>0.05)，無統(tǒng)計學(xué)意義。給藥組跟模型組相比體質(zhì)量無顯著差別(P>0.05)，無統(tǒng)計學(xué)意義；海藻糖濃度明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；三酰甘油濃度明顯降低,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);蛋白濃度無顯著差別(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表2。

組 別體質(zhì)量/mg海藻糖濃度/(mg/dL)蛋白濃度/(mg/mL)三酰甘油濃度/(μg/mg)空白組5．27±0．172．81±0．70 0．42±0．0332．55±3．69 模型組5．21±0．164．02±0．64Δ0．38±0．0452．20±3．92ΔΔ給藥組5．09±0．163．01±0．70#0．45±0．0641．50±4．84#

注：與模型組相比，#P<0.05；與空白組相比，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

3 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明，鬼箭羽配伍荔枝核對高糖和高脂誘導(dǎo)的果蠅糖尿病模型的海藻糖、三酰甘油濃度均有降低作用，鬼箭羽配伍荔枝核對高糖誘導(dǎo)的果蠅糖尿病模型的海藻糖濃度及三酰甘油濃度的降低效果更顯著；表明鬼箭羽配伍荔枝核有很好的降糖作用；但對高糖和高脂誘導(dǎo)的果蠅糖尿病模型蛋白濃度均無降低的作用，而且與模型組相比，給藥組的蛋白濃度均有一定程度的升高，文獻報道，鬼箭羽是有小毒的，本實驗中，在對高糖和高脂誘導(dǎo)的果蠅糖尿病模型的海藻糖、三酰甘油濃度降低的同時，對2種模型的蛋白濃度均無明顯的影響，而且對高脂誘導(dǎo)模型的體質(zhì)量也無影響，也從側(cè)面說明了鬼箭羽配伍荔枝核在具有顯著降糖的劑量下可能不產(chǎn)生明顯的毒性，為臨床安全用藥提供了依據(jù)。

Matthieu Y等[2]在研究高糖食物誘導(dǎo)的果蠅胰島素抵抗模型載脂蛋白神經(jīng)元性質(zhì)時發(fā)現(xiàn)：果蠅在胰島素抵抗機制方面與人類基本相同。Palanker Mussel man L等[3]在對高糖食物會導(dǎo)致野生型果蠅肥胖和胰島素抵抗研究時發(fā)現(xiàn)用高糖食物喂養(yǎng)后的果蠅，會出現(xiàn)胰島素抵抗(insulin resistance,IR)、空腹血糖和脂肪升高等2型糖尿病的癥狀。Sean Oldham[4]的研究也表明高脂食物誘導(dǎo)的果模型可以作為人類研究代謝疾病的有用模型，這些疾病包括高脂食物誘導(dǎo)的肥胖、糖尿病、心臟病。

國醫(yī)大師周仲瑛教授對糖尿病及其并發(fā)癥的治療有獨到的見解，創(chuàng)立了消渴病“瘀熱致消”學(xué)說[5]。臨床常用涼血化瘀中藥治療糖尿病。鬼箭羽和荔枝核是周老常用的一組對藥,本研究以高糖和高脂誘導(dǎo)的果蠅2型糖尿病模型，符合人類糖尿病瘀熱證候特點。實驗證明,鬼箭羽配伍荔枝核對果蠅2型糖尿病模型的海藻糖濃度、三酰甘油濃度有較好的作用，對蛋白質(zhì)無影響，是否和鬼箭羽毒性有關(guān)，有待探討。

正如《血證論》所云：“瘀血在里則口渴。所以然者，血與氣本不相離，內(nèi)有瘀血，故氣不得通，不能載水津上升，是以發(fā)渴，名曰血渴，疲去則不渴矣?！泵鞔_闡述了瘀血與消渴的關(guān)系。故涼血化瘀為糖尿病重要的治療方法。

鬼箭羽，其性味功能為味苦性寒，有小毒，有清熱破血消瘀、殺蟲止痛之功。對其藥理研究發(fā)現(xiàn)，鬼箭羽可以直接作用在胰島B細胞上，促進胰島B細胞群增生，釋放胰島素，促進組織中的葡萄糖代謝與加速肝糖原的合成，從而改善血糖水平[6]。荔枝核性甘、溫、無毒，入肝、腎經(jīng),具有溫中、理氣、止痛的功效,主要成份有皂甙、蒜質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、揮發(fā)成分等。已有研究證實[7]，荔枝核水提物和醇提取物均具有降低糖尿病大鼠血糖水平、調(diào)節(jié)血脂、改善模型鼠高胰島素血癥和IR及抗氧化作用。臨床上常用鬼箭羽配伍荔枝核加減治療糖尿病及其并發(fā)癥。本實驗采用果蠅作為實驗動物模型，作為經(jīng)典的模式生物，果蠅在21世紀的遺傳學(xué)研究中將發(fā)揮更加巨大而不可替代的作用。

對于哺乳動物模型而言，果蠅有著較少的冗余基因，利用保守的信號通路和代謝途徑行使基本的代謝功能，從而利于發(fā)現(xiàn)基因在調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和代謝途徑中的作用[8]。鬼箭羽和荔枝核的成分復(fù)雜多樣，關(guān)于二者單藥降糖降脂作用的報道有很多，雖然臨床這2味藥經(jīng)常用于糖尿病治療，但暫無對二者配伍降低血糖血脂的報道。發(fā)揮作用的藥物成分也可能是多因素、多靶點、多途徑綜合作用的結(jié)果。其具體的降糖降脂機制和機理有待進一步深入研究。2型糖尿病(T2DM)是由遺傳因素和環(huán)境因素共同引起的一組以糖代謝紊亂為主要表現(xiàn)的臨床綜合征，2型糖尿病以胰島素抵抗和胰島B細胞功能受損為特征。胰島素缺乏和胰島素作用障礙單獨或同時引起糖類、脂肪、蛋白質(zhì)、水和電解質(zhì)等的代謝紊亂，臨床以慢性高血糖為主要特征。2型糖尿病患者常有脂代謝紊亂,脂代謝異常又進一步加重糖代謝紊亂，二者互為因果關(guān)系。有效的控制血糖、調(diào)節(jié)血脂能減少糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展，尋找有效的降糖同時兼有降脂療效的藥物，有著巨大的臨床和社會意義。

[1]周仲瑛.論瘀熱[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2006,22(5):273-231.

[2]Matthieu Y,Pasco,Pierre le opold.High Sugar-Induced Insulin Resistance in Drosophila Relies on the Lipocalin Neural Lazarillo[J].PLoS One,2012(5):1-8.

[3]Palanker Mussel man L,Fink J L,Narzinski K.Ramac handran PV:A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila[J].Dis Model Mech,2011(4):842-849.

[4]Sean Oldham.Obesity and nutrient sensing TOR pathway in flies and vertebrates:Functional conservation of genetic mechanisms[J].Cell press,2011(2):45-52.

[5]周仲瑛.糖尿病雜談[J].江西中醫(yī)藥,2001,32(2)15-16.

[6]姜志華.箭羽在治療消渴病中的應(yīng)用[J].中華中醫(yī)藥雜志,2007(增刊1):243-244.

[7]賈淑明,劉銅華.常用中藥及其活性成份抗糖尿病的作用及機制[C]//第九次全國中醫(yī)糖尿病學(xué)術(shù)大會論文匯編,石家莊:中華中醫(yī)藥學(xué)會糖尿病分會,2006.

[8]Baker KD,Thummel C S.Diabetic larvae and obese flies-emerging studies of metabolism in Drosophila[J].Cell Metab,2007(6):257-266.