胡晶晶，楊珺超，汪 潞，江立斌△

（1.浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，浙江杭州310053；2.浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院、浙江省中醫(yī)院，浙江杭州310006）

哮喘是一種異質(zhì)性疾病，通常以慢性氣道炎癥為特征。其定義包括呼吸道癥狀如隨時間而強度變化的喘息、氣短、胸悶與咳嗽，伴隨不同程度的呼氣氣流受限，是一種與免疫、遺傳、感染、環(huán)境等眾多因素相關(guān)的疾病。目前研究發(fā)現(xiàn)氣道重構(gòu)與重癥哮喘所導致的肺功能下降密切相關(guān)，近年來其被認為是引起不可逆性氣道阻塞和難治性哮喘的病理基礎和重要原因之一[1]，但是哮喘引起氣道重構(gòu)的發(fā)病機制至今尚未闡明。在正常生理情況下，基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）及其組織抑制物-1（TIMP-1）保持平衡狀態(tài)，MMP-9/TIMP-1 失衡則會導致細胞外基質(zhì)代謝異常，參與氣道重塑過程[2]。本實驗通過建立小鼠哮喘模型，探討穿山龍總皂苷對哮喘氣道重構(gòu)的作用及對MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級雌性BALB/c 小鼠60 只，6～8 周齡，體質(zhì)量（18±2）g。隨機分成6 組，每組10 只：A 組（正常對照組），B 組（哮喘模型組），C 組[陽性對照組（醋酸潑尼松組）]，D 組（穿山龍總皂苷低劑量組），E組（穿山龍總皂苷中劑量組），F(xiàn) 組（穿山龍總皂苷高劑量組）。

1.2 動物模型的建立

采用卵白蛋白（OVA）注射霧化吸入致敏激發(fā)法復制哮喘小鼠模型。取0.05 mg OVA+10%硫酸鋁鉀混懸液0.1 mL 于實驗第0 天和第12 天腹腔注射以致敏小鼠，第18-23 天連續(xù)每天予5% OVA 生理鹽水溶液超聲霧化激發(fā)，30 min/次，1 次/d，第26 天起，予5% OVA 生理鹽水溶液超聲霧化激發(fā)，30 min/次，3 次/周，末次霧化為第55 天。霧化在30*40*40crn 大小的透明塑料盒中分組進行。正常對照組用等量生理鹽水替代OVA 混懸液進行腹腔注射和霧化吸入。

1.3 藥物干預

各組分別于實驗第18 天起灌胃給藥，陽性對照組給醋酸潑尼松混懸液10 mg/kg，治療組按穿山龍總皂苷高、中、低劑量組每天灌胃分別給予穿山龍總皂苷20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg。穿山龍總皂苷以含0.01%吐溫80 為溶媒的生理鹽水做溶劑，當日配制。正常對照組、模型對照組給予相同體積的含上述溶媒的生理鹽水。各組均于實驗第18 天起霧化吸入后給藥，每天1 次，連續(xù)給藥至第55 天。

1.4 標本收集

每只小鼠最后1 次霧化激發(fā)后24 h 內(nèi)頸椎脫臼處死，開胸，用含1%肝素的無菌生理鹽水100 mL快速沖洗肺血管床后，取肺組織存于-80 ℃冰箱。

1.5 HE 染色

取適量肺組織用生理鹽水沖洗干凈后利用10%中性福爾馬林溶液固定，常規(guī)脫水，石臘包埋。制成切片后行HE 染色，中性樹脂封片，光學顯微鏡觀察氣道粘膜組織形態(tài)，測定氣道平滑肌面積和氣道內(nèi)壁面積，觀察炎癥細胞浸潤程度等。

1.6 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測MMP-9、TIMP-1 蛋白的表達

以蛋白裂解液提取部分肺組織總蛋白質(zhì)，以BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度。取30 μg 蛋白樣品經(jīng)12%的十二烷基磺酸鈉－聚丙酰胺凝膠電泳分離后，半干電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。1%牛血清白蛋白（BSA）4 ℃封閉過夜。0.05%的Tween-20 磷酸鹽緩沖液（PBST）洗膜后與1∶400 的Ⅰ抗（羊抗鼠α-SMA、MMP-9和TIMP-1 多克隆抗體）反應2h。然后與1∶3 000 的辣根過氧化酶標記的Ⅱ抗（兔抗羊IgG）孵育1h。β-Actin Ⅰ抗（羊抗鼠β-Actin 多克隆抗體）濃度為1∶500，辣根過氧化酶標記的Ⅱ抗（兔抗羊IgG）濃度為1∶5 000。DAB 顯色。目的蛋白呈棕紅條帶，晾干后拍照，以凝膠成像系統(tǒng)掃描比較。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS12.0 統(tǒng)計軟件處理。實驗數(shù)據(jù)用（x±s）表示，各指標間比較用單因素方差分析，隨后采用q 檢驗進行兩兩比較。2 組數(shù)據(jù)相關(guān)分析采用spearman 等級相關(guān)分析。計數(shù)資料分析采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 穿山龍總皂苷對哮喘小鼠支氣管肺組織病理學的影響

空白組小鼠氣道上皮結(jié)構(gòu)正常，氣道周圍未見淋巴細胞及其他炎癥細胞的浸潤。見圖1A。模型組小鼠氣管上皮變性，氣道壁明顯增厚，黏膜下及管壁周圍有大量炎性細胞浸潤，氣道平滑肌增厚，見圖1B。陽性對照組可見氣道壁及上皮結(jié)構(gòu)等方面較哮喘組均改善，炎癥細胞浸潤明顯減少，但未完全消失。穿山龍總皂苷低、中、高劑量組小鼠支氣管平滑肌的增厚、肺泡壁水腫及氣道炎性細胞浸潤均有所改善，見圖1C、D、E，其中高劑量組改善最為明顯。

圖1 各組肺組織病理（HE 染色，×100）

2.2 應用Western blot 法測定穿山龍總皂苷對氣道重構(gòu)相關(guān)蛋白MMP-9 及TIMP-1 的表達

與空白對照組比較，小鼠哮喘模型組MMP-9表達明顯升高（P＜0.05），TIMP-1 表達明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組MMP-9 表達明顯降低（P＜0.05），TIMP-1 表達明顯升高（P＜0.05）；但MMP-9 在各穿山龍總皂苷組表達強于陽性對照組，TIMP-1 在各穿山龍總皂苷組表達弱于陽性對照組；穿山龍總皂苷各劑量組MMP-9 表達隨劑量增加而降低，TIMP-1 表達隨劑量增加而增加。（圖2a、b）。

圖2 穿山龍總皂苷對MMP-9 及TIMP-1 蛋白表達的影響

3 討論

哮喘發(fā)病機制尚不完全清楚，目前認為，變態(tài)反應、氣道炎癥、氣道重構(gòu)等方面共同參與哮喘的發(fā)病過程[3]。氣道慢性炎癥被認為是哮喘的基本的病理改變和哮喘反復發(fā)作的主要病理生理機制[4]。但近來諸多實驗顯示單純抗炎治療對哮喘的治療卻不甚理想[5]。氣道長期持續(xù)性的炎癥反復發(fā)作，反復修復，會導致組織增生而發(fā)生重塑[6]。因此只有控制或者逆轉(zhuǎn)了氣道重構(gòu)，哮喘才可能得到真正意義上的控制。

目前研究表明：細胞外基質(zhì)(ECM) 在氣道壁降解與沉積失衡、氣管平滑肌(airwaysmoothmusele,ASM)增生肥大、基底膜增厚及管壁玻璃樣變是支氣管哮喘氣道重塑的重要原因之一。ECM 降解中起關(guān)鍵作用的是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，是ECM 代謝的主要限速酶，具有限制ECM 降解的作用，從而使ECM 沉積增加[7]，而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物(TIMPs)是MMPs 的特異性抑制劑，它可抑制MMPs 的活性而使ECM 降解增加，沉積減少。MMP-9 及其抑制劑TIMP-1 與哮喘氣道重塑關(guān)系最大[7-8]。研究證實MMP-9/TIMP-1 失衡可能是急性或慢性哮喘的特征。在對哮喘患者的研究中發(fā)現(xiàn)，由于炎癥的反復刺激，MMP-9 表達失衡，表現(xiàn)為EMC 降解和合成紊亂，進而導致氣道異常修復和損傷，最終發(fā)展成氣道重構(gòu)[9-10]。

中藥穿山龍為薯蕷科植物穿龍薯蕷（Dioscorea nipponica Makino）的干燥根莖。多用于治療風寒濕痹、慢性氣管炎、消化不良、勞損扭傷等?，F(xiàn)代藥理研究表明，穿山龍具有調(diào)節(jié)免疫、改善心血管功能、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等多種藥理作用，可用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎、冠心病心絞痛、慢性氣管炎、慢性布魯菌病、脂肪瘤等疾病[11-12]。據(jù)抗炎反應試驗，穿山龍在試管中的濃度大體相當于血中有效濃度時，有抑制過敏介質(zhì)釋放的作用及調(diào)節(jié)免疫的作用[13～14]。在許多中醫(yī)藥復方中均選用了穿山龍作為主要藥物治療支氣管哮喘；穿山龍注射液也被用于穴位注射治療重癥支氣管哮喘，有資料表明效果明顯[15]。但穿山龍總皂苷治療支氣管哮喘的實驗研究報道較少。而穿山龍總皂苷對哮喘氣道壁重塑的影響及其可能機制未見報道。

傳統(tǒng)的中醫(yī)認為哮喘病因病機主要以"痰飲"為主，治療中采用化痰等方法能取得很好的療效。本文研究結(jié)果顯示，對于哮喘小鼠，穿山龍可改善氣道壁及氣道上皮結(jié)構(gòu)，減少黏膜下及管壁周圍炎性細胞浸潤，在進一步機制研究中我們發(fā)現(xiàn)，陽性對照組及低、中、高劑量組MMP-9 和TIMP-1 表達水平均較哮喘模型組改善，并且穿山龍與陽性對照組有類似的減輕氣道重塑的作用機制，此外，我們還發(fā)現(xiàn)MMP-9 表達強度可能隨穿山龍總皂苷劑量的增加而減弱，TIMP-1 表達強度可能隨穿山龍總皂苷劑量的增加而增加。說明穿山龍總皂苷可能是通過抑制肺組織內(nèi)MMP-9、增加TIMP-1 的表達而減輕氣道重塑，這與醋酸潑尼松減輕氣道重塑的機制類似。

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