劉世超，盧軒，馮寶民，鄭學(xué)仿，張寧，王惠國

(大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622)

芥子堿主要存在于十字花科(cruciferae)植物中，為季胺類生物堿，是芥子酸與膽堿形成的酯［1］。已有研究表明，芥子堿具有廣泛的藥理活性，如降血壓［2］、抗衰老［3］、抗輻射［4］、抗氧化［5］、抗雄激素等作用［6］。本研究前期［7］對芥子堿氯化鹽的降壓作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)芥子堿氯化鹽具有較強(qiáng)的降壓作用，作為降壓藥物先導(dǎo)化合物具有潛在的研究價值，但目前尚未見到有關(guān)芥子堿降壓作用機(jī)理的研究。本文通過研究芥子堿氯化鹽對家兔離體腸平滑肌收縮功能的影響，旨在考查芥子堿氯化鹽對離體腸管平滑肌的作用，為芥子堿降壓作用機(jī)理的研究提供線索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

成年健康新西蘭長耳白兔，體質(zhì)量2.0～2.5kg，雌雄兼用，遼寧省大連市大連醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，SCXK(遼)2013－0003。

1.2 主要儀器及試劑

Medlab－U/4C501H生物信號采集處理系統(tǒng)(南京美易科技有限公司);BP 211D型電子天平(德國賽多利斯);恒溫平滑肌浴槽(張家港市南港醫(yī)療器械廠);FT－100生物張力傳感器(成都泰盟電子有限公司);硫酸阿托品注射液(鄭州羚銳制藥股份有限公司，批號1005051);氯化鈉(青島化學(xué)試劑廠，批號050616);氯化鉀(河南焦作市化工三廠，批號990911);無水氯化鈣(天津市廣成化學(xué)試劑有限公司，批號20020504);碳酸氫鈉(山東省化工研究院，批號990902);葡萄糖(青島化學(xué)試劑廠，批號040716);MgSO4·7H2O(開原化學(xué)試劑廠，批號 990201);NaH2PO4·2H2O(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，批號030828);皆為分析純。芥子堿氯化鹽為本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)HPLC檢測純度為99.9%。

2 方法

2.1 家兔離體腸管的制備

取禁食24h家兔15只，槌擊后枕部致死，迅速剖開腹腔，分離回腸，去除腸壁周圍腸系膜，分離出長約30cm的腸管，立刻置于37℃充入95%O2和5%CO2的混合氣體的臺氏液中，腸管出現(xiàn)明顯蠕動時剪成2cm的腸段，用臺氏液把腸內(nèi)容物沖洗干凈后備用。

2.2 芥子堿氯化鹽對家兔離體腸管收縮功能的影響［8－9］

取2.1制備的離體腸管，上端接肌張力換能器，下端固定在金屬鉤上，將固定好的腸管置于充滿20ml臺氏液(37±0.5)℃的麥?zhǔn)显〔壑?，打開生物信號采集處理系統(tǒng)，設(shè)置參數(shù)為:直流，濾波調(diào)節(jié)F=30Hz，時間掃描速度S(1.0s/div)，調(diào)整標(biāo)本初負(fù)荷為2.0g，每次篩選5個舒縮頻率、張力穩(wěn)定的腸管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，腸管蠕動平穩(wěn)30min后，向5個麥?zhǔn)显〔壑蟹謩e加入不同濃度(0、5、10、20、40ug/ul)芥子堿氯化鹽溶液，每個濃度的給藥體積為5ul，每個濃度重復(fù)15次實(shí)驗(yàn)，以0ug/ul芥子堿氯化鹽作為空白對照，用MedLab生物信號采集處理系統(tǒng)軟件記錄并分析腸管的蠕動波形，用區(qū)間測量法測量給藥前1min及給藥后第5min的頻率、張力，按下列公式計算頻率變化率、張力變化率。

頻率變化率(%)=(給藥后頻率－給藥前頻率)/給藥前頻率×100%

張力變化率(%)=(給藥后張力－給藥前張力)/給藥前張力×100%

2.3 M受體阻斷劑對芥子堿氯化鹽收縮腸管作用的影響［10］

制備4條離體腸管，待標(biāo)本舒縮平衡后，分別采用下述4種給藥順序考察芥子堿氯化鹽對阿托品所致回腸舒張的影響。1)1%芥子堿氯化鹽→1%阿托品(圖1A);2)1%阿托品→1%芥子堿氯化鹽(圖1B);3)1%芥子堿氯化鹽→1%阿托品→1%芥子堿氯化鹽(圖1C);4)10%阿托品→1%芥子堿氯化鹽→10%阿托品(圖1D)，每次實(shí)驗(yàn)給藥量均為5ul。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有結(jié)果采用(s)表示，給藥前后比較采用組內(nèi)配對t檢驗(yàn)，變化率比較采用方差分析。

3 結(jié)果

3.1 芥子堿氯化鹽對家兔離體腸管收縮功能的影響見表1～2。

表1 芥子堿氯化鹽對家兔離體腸平滑肌收縮頻率的影響(n=15，s)

表1 芥子堿氯化鹽對家兔離體腸平滑肌收縮頻率的影響(n=15，s)

芥子堿氯化鹽濃度(ug/ul)給藥前 給藥后頻率F(次/min)頻率變化率(%)0 0.249 ±0.014 0.252 ±0.015 1.67 ±0.648 5 0.243 ±0.019 0.248 ±0.013 2.75 ±0.089 10 0.243 ±0.019 0.246 ±0.050 2.02 ±0.228 20 0.249 ±0.012 0.252 ±0.016 1.32 ±0.835 40 0.246 ±0.018 0.243 ±0.008 －0.59 ±0.770

表2 芥子堿氯化鹽對家兔離體腸平滑肌張力的影響(n=15，s)

表2 芥子堿氯化鹽對家兔離體腸平滑肌張力的影響(n=15，s)

注:與給藥前后比較，#P＜0.05，##P ＜0.01;與空白對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

芥子堿氯化鹽濃度(ug/ul)給藥前 給藥后張力(g)張力變化率(%)0 2.038 ±0.031 2.045 ±0.036 1.596 ±0.243 5 2.095 ±0.124 2.264 ±0.091# 8.423 ±0.753＊＊10 2.062 ±0.049 2.290 ±0.121## 11.075 ±0.560＊＊20 2.077 ±0.023 2.328 ±0.118## 12.078 ±0.578＊＊40 2.137 ±0.059 2.496 ±0.220## 16.822 ±1.041＊＊

由表1可見，與給藥前相比，給予芥子堿氯化鹽后家兔離體腸平滑肌收縮頻率變化差異不顯著(P＞0.05)，芥子堿氯化鹽不會引起離體腸平滑肌收縮頻率的變化。由表2可見，芥子堿氯化鹽給藥后家兔離體腸平滑肌張力均較給藥前提高且差異顯著(P＜0.01)，組間比較結(jié)果顯示，與空白對照組相比各實(shí)驗(yàn)濃度的芥子堿氯化鹽均可顯著提高家兔離體腸平滑肌張力，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

3.2 M受體阻斷劑對芥子堿氯化鹽收縮腸管作用的影響 見圖1。

圖1 M受體阻斷劑對芥子堿氯化鹽收縮腸管作用的影響

圖1A顯示，芥子堿氯化鹽興奮腸管的作用可以部分被M受體阻斷劑阿托品阻斷;圖1B顯示，芥子堿氯化鹽可以拮抗M受體阻斷劑阿托品所致的腸管舒張;圖1A，1B結(jié)果提示，M膽堿受體途徑參與了芥子堿氯化鹽興奮腸管的作用。圖1C顯示，阿托品抑制芥子堿氯化鹽興奮腸管的作用可以被再次加入的芥子堿氯化鹽所逆轉(zhuǎn)，提示芥子堿氯化鹽與阿托品之間存在著競爭M受體的作用。圖1D顯示，在浴槽中預(yù)先加入封閉M受體劑量的阿托品(10%)育后再加入芥子堿氯化鹽，引起的收縮小于空白對照(基線)引起的收縮，說明阿托品的確具有拮抗芥子堿氯化鹽的作用，但這種拮抗作用并不完全，在封閉劑量阿托品存在的情況下芥子堿氯化鹽仍能夠表現(xiàn)出興奮離體腸管的作用，且這種作用不會被再次加入10%阿托品逆轉(zhuǎn)，提示除了M膽堿受體途徑激動外，還可能存在其他途徑參與了芥子堿氯化鹽對腸管的興奮作用。

4 結(jié)論與討論

芥子堿(Sinapine)是普遍存在于十字花科植物(Folium Isatidis)中的一種天然酚類小分子季銨類生物堿。其結(jié)晶體為棕色針狀，易溶于水、甲醇和乙醇，熱穩(wěn)定(100℃)，熔點(diǎn)為179℃，在326 nm處有一紫外吸收峰，在弱酸性溶液中穩(wěn)定，在堿性溶液中不穩(wěn)定，易分解為芥子酸和膽堿。芥子堿在自然界中只有極少一部分是以單體的形式存在，常與有機(jī)酸結(jié)合成鹽存在，或以糖苷、有機(jī)酸酯和酰胺的形式存在，在十字花科藥用植物中芥子堿以芥子堿硫氰酸鹽的形式存在最為廣泛。芥子堿硫氰酸鹽溶解度不好，故本研究開展了芥子堿氯化鹽對家兔離體腸平滑肌收縮功能的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芥子堿氯化鹽的作用性質(zhì)是興奮離體腸管，且這種作用具有一定的劑量依賴性(5～40ug/ul)，為進(jìn)一步探究芥子堿興奮離體腸管的作用機(jī)制，本研究采用M膽堿受體配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，考察其是否通過M受體通路興奮腸管平滑肌。圖1A，1B顯示，芥子堿氯化鹽興奮腸管的作用可以部分被M受體阻斷劑阿托品阻斷且芥子堿氯化鹽可以拮抗M受體阻斷劑阿托品所致的腸管舒張，也就是說M膽堿受體途徑參與了芥子堿氯化鹽興奮腸管的作用。圖1C顯示，阿托品抑制芥子堿氯化鹽興奮腸管的作用可以被再次加入的芥子堿氯化鹽所逆轉(zhuǎn)，這種現(xiàn)象的出現(xiàn)有兩種推測，一是芥子堿氯化鹽除了可以激動M受體外，還可能通過其他通路實(shí)現(xiàn)提高離體腸管張力的作用，二是芥子堿氯化鹽與阿托品之間存在著競爭M受體的作用，阿托品劑量低不足以封閉所有腸管上的M受體。針對上述假設(shè)本研究采用大劑量阿托品(10%)孵育離體腸管，當(dāng)阿托品完全阻斷M受體后再加入芥子堿氯化鹽(圖1D)，結(jié)果顯示，大劑量阿托品使腸管呈現(xiàn)完全松弛狀態(tài)，但并不能完全阻斷芥子堿氯化鹽對腸管的興奮作用，且這種興奮作用不會被再次加入的大劑量阿托品所競爭性減弱，結(jié)合圖1C、1D說明阿托品的確與芥子堿氯化鹽存在競爭M受體的作用，但除了M膽堿受體途徑外還有其他途徑參與了芥子堿氯化鹽對腸管的興奮作用，但究竟還有哪些途徑參與了芥子堿興奮離體腸管，仍需要進(jìn)一步探索。

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