紅鳳菜總黃酮的富集方法

任冰如+陳劍+呂寒+等

摘要：探討從紅鳳菜新鮮莖葉中富集總黃酮的方法，以槲皮素為對(duì)照品，用比色法測(cè)定樣品中的總黃酮含量；以紅鳳菜新鮮莖葉為原料，比較用不同濃度乙醇提取總黃酮的效果；以乙醇粗提物為試驗(yàn)樣品，比較不同吸附材料在靜態(tài)和動(dòng)態(tài)情況下對(duì)總黃酮的吸附和解吸附性能。結(jié)果得到總黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=2.215 7x-0.2511，r=0.999 1（n=3），其中x為吸光度，y為槲皮素的質(zhì)量（mg）；結(jié)果還表明，用95%乙醇提取總黃酮的效果最佳，用大孔樹(shù)脂NKA分離總黃酮的效果最好，此外D-101、HPD-100、X-5也有較好的分離效果。綜合研究結(jié)果認(rèn)為，用95%乙醇作提取溶劑、用NKA大孔樹(shù)脂吸附層析，可有效地富集紅鳳菜新鮮莖葉中的總黃酮。

關(guān)鍵詞：紅鳳菜；總黃酮；提??；分離

中圖分類(lèi)號(hào)： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）06-0260-03

收稿日期：2013-09-23

項(xiàng)目來(lái)源：江蘇省產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合創(chuàng)新資金（編號(hào)：BY2012213）；江蘇省科技基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)計(jì)劃-科技公共服務(wù)平臺(tái)項(xiàng)目（編號(hào)：BM2011117）。

作者簡(jiǎn)介：任冰如（1964—），女，江蘇宜興人，博士，研究員，主要從事植物資源的研究與開(kāi)發(fā)工作。Tel：（025）84347081；E-mail：renbingru@263.net。

通信作者：李維林，博士，研究員，研究方向?yàn)橹参飳W(xué)。E-mail：lwlcnbg@mail.cnbg.net。紅鳳菜（Gynura bicolor）為菊科菊三七屬植物，別稱血皮菜、觀音菜、觀音莧、紫背天葵等，可以作為蔬菜食用，近年來(lái)在江蘇等多個(gè)地區(qū)都有栽培和銷(xiāo)售。紅鳳菜全草可入藥，味甘、辛，性涼，具有涼血止血、清熱消腫的功效[1]。有研究顯示，紅鳳菜含有黃酮類(lèi)物質(zhì)[2-4]，黃酮類(lèi)物質(zhì)具有保護(hù)心血管、抗腫瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗病毒等活性[5]，因此從紅鳳菜中提取黃酮類(lèi)物質(zhì)具有重要意義。本試驗(yàn)以紅鳳菜的新鮮莖葉為原料，探討用不同濃度乙醇提取總黃酮的效果，并在此基礎(chǔ)上選用不同吸附材料對(duì)紅鳳菜粗提物中的總黃酮進(jìn)行吸附與解吸附試驗(yàn)，以期篩選分離效果優(yōu)良的吸附材料，有效地富集總黃酮。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)儀器

Mettler AE-240十萬(wàn)分之一電子天平；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BM252C電動(dòng)攪拌機(jī)，廣東美的精品電器制造有限公司；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HY-4A數(shù)顯調(diào)速多用振蕩器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2試驗(yàn)材料

紅鳳菜于2003年7月引自中國(guó)重慶，憑證標(biāo)本號(hào)0648614，憑證標(biāo)本保存于江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所標(biāo)本館（NAS）。紅鳳菜的新鮮莖葉采自江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所的試驗(yàn)苗圃中。

NKA大孔樹(shù)脂，購(gòu)自南開(kāi)大學(xué)化工廠；AB-8大孔樹(shù)脂，購(gòu)自天津南開(kāi)和成科技有限公司；HPD-100、X-5大孔樹(shù)脂，購(gòu)自河北滄州寶恩化工有限公司；D101大孔樹(shù)脂，購(gòu)自天津海光化工有限公司；100-200目聚酰胺粉末，購(gòu)自浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠。

1.3試驗(yàn)試劑

槲皮素對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100081-200907，ID：A34P-2DV6。所用試劑均為分析純。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1總黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及樣品總黃酮含量的測(cè)定精確稱取12.1 mg槲皮素對(duì)照品，用80%乙醇定容至 50 mL，即配成濃度為0.242 g/L的溶液。分別精確吸取0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL槲皮素對(duì)照品溶液至7支試管中，每個(gè)濃度重復(fù)3次；分別加入0.3 mL 5% NaNO2，搖勻；6 min后分別加入0.3 mL 10% Al（NO3）3，搖勻后放置6 min；加入4.0 mL 4% NaOH并加水定容至10 mL，放置10～15 min；在510 nm處測(cè)定吸光度值（D510 nm）。以加入的槲皮素含量（mg）為縱坐標(biāo)，測(cè)得的D510 nm為橫坐標(biāo)，計(jì)算線性相關(guān)方程，作為測(cè)定總黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取一定體積的待測(cè)樣品代替槲皮素對(duì)照品，以相同的方法測(cè)定D510 nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的總黃酮含量。

1.4.2不同濃度乙醇提取紅鳳菜總黃酮的試驗(yàn)稱取4份20 g紅鳳菜鮮葉，分別加入100 mL體積分?jǐn)?shù)為0、50%、70%、95%的乙醇水溶液，電動(dòng)攪拌機(jī)勻漿后用超聲波提取1 h（設(shè)定溫度為50 ℃，功率為90%），過(guò)濾后精確吸取3 mL濾液，按“1.4.1”中的方法測(cè)定總黃酮含量，每個(gè)樣品重復(fù)2次。分別取3 mL不同濃度的乙醇提取液并用70%乙醇定容到10 mL，作為不同提取液的空白對(duì)照。

1.4.3不同層析材料對(duì)紅鳳菜總黃酮的吸附分離特性試驗(yàn)

1.4.3.1紅鳳菜總黃酮提取液的制備稱取1 000 g新鮮紅鳳菜莖葉，加入4 000 mL 95%乙醇，超聲波提取后過(guò)濾，將濾渣重復(fù)提取1次，合并濾液并濃縮至500 mL，置于冰箱中沉淀去雜；過(guò)濾后取濾液，減壓濃縮以去除殘余乙醇，定容至250 mL，得紅鳳菜總黃酮粗提液。

1.4.3.2不同層析材料的靜態(tài)吸附篩選試驗(yàn)分別稱取 1.00 g 處理過(guò)的NKA大孔樹(shù)脂、HPD-100大孔樹(shù)脂、D101大孔樹(shù)脂、X-5大孔樹(shù)脂、AB-8大孔樹(shù)脂和100～200目聚酰胺粉末，裝入三角瓶中后分別加入20.0 mL紅鳳菜總黃酮粗提液，振蕩4 h以使總黃酮充分被吸附，過(guò)濾即得20.0 mL吸附液。取上述飽和吸附后的層析材料，分別加入15.0 mL 80%乙醇，振蕩4 h使總黃酮充分解吸附，過(guò)濾即得 15.0 mL 解吸附液。吸取0.1 mL各吸附液、解吸附液，按“1.4.1”中的方法測(cè)定總黃酮含量，按照下列公式計(jì)算不同層析材料在室溫下的吸附量、吸附率、解吸附量及解吸附率。endprint

吸附量（mg/g）=（原液總黃酮含量×原液體積-吸附液總黃酮含量×吸附液體積）/樹(shù)脂質(zhì)量；

吸附率=[（原液總黃酮含量-吸附液總黃酮含量）/原液總黃酮含量]× 100%；

解吸附量（mg/g）=（解吸液總黃酮含量×解吸液體積）/樹(shù)脂質(zhì)量；

解吸率= 解吸附量/吸附量×100%。

1.4.3.3不同層析材料的動(dòng)態(tài)吸附篩選試驗(yàn)分別稱取 3.00 g 處理過(guò)的NKA大孔樹(shù)脂、HPD-100大孔樹(shù)脂、D101大孔樹(shù)脂、X-5大孔樹(shù)脂、AB-8大孔樹(shù)脂和100～200目聚酰胺粉末，按濕法裝柱，得床體積5 mL；用10倍床體積的純凈水洗滌，吸取10.0 mL紅鳳菜總黃酮提取液上柱，收集流出液，得10.0 mL過(guò)柱流出液；各柱加水10 mL洗脫，收集流出液，得10 mL水洗脫液；再加入15 mL 80%乙醇洗脫并收集流出液，得15 mL解吸附液。用上述方法測(cè)定各溶液中的總黃酮含量。按以下公式計(jì)算不同層析材料的上柱量、吸附量、解吸附量和解吸附率。

上柱量（mg/g）=（原液總黃酮含量×原液體積-過(guò)柱流出液總黃酮含量×過(guò)柱流出液體積）/樹(shù)脂質(zhì)量；

吸附量（mg/g）=（原液總黃酮含量×原液體積-過(guò)柱流出液總黃酮含量×過(guò)柱流出液體積-水洗脫液總黃酮含量×水洗脫液體積）/樹(shù)脂質(zhì)量；

解吸附量（mg/g）=（解吸液總黃酮含量×解吸液體積）/樹(shù)脂質(zhì)量；

解吸附率=解吸附量/吸附量×100%。

2結(jié)果與分析

2.1總黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以槲皮素為對(duì)照品，用比色法測(cè)得的總黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中x為吸光值，y為槲皮素的質(zhì)量（mg），回歸方程為：y=2.215 7x-0.251 1，r=0.999 1（n=3）。可以看出槲皮素在0.242 ～0.968 mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2不同濃度乙醇提取紅鳳菜總黃酮的試驗(yàn)

水提液中的總黃酮含量最低，隨著乙醇濃度的增加，提取液中的總黃酮含量明顯增加，以95%乙醇的提取效果最好。

不同乙醇濃度對(duì)紅鳳菜新鮮莖葉中總黃酮的提取效果

樣品編號(hào)乙醇濃度

（%）提取液的總黃酮含量（mg/mL）重復(fù)1重復(fù)2平均值100.0040.0050.0052500.2080.2260.2173700.8340.7580.7964950.8850.9110.898

2.3不同層析材料對(duì)紅鳳菜總黃酮的吸附分離特性試驗(yàn)

2.3.1不同層析材料的靜態(tài)吸附篩選試驗(yàn)各種層析材料對(duì)紅鳳菜總黃酮的靜態(tài)吸附效果。

不同層析材料的對(duì)紅鳳菜總黃酮的靜態(tài)吸附效果

層析材料類(lèi)型結(jié)構(gòu)

特性吸附量

（mg/g）吸附率

（%）解吸附量

（mg/g）解吸附率

（%）NKA大孔樹(shù)脂非極性12040.96150.6HPD-100大孔樹(shù)脂非極性14549.57652.1D-101大孔樹(shù)脂非極性15051.17751.5X-5大孔樹(shù)脂非極性12542.77056.2AB-8大孔樹(shù)脂弱極性12943.96550.8聚酰胺極性12743.46147.9

可以看出，5種大孔樹(shù)脂對(duì)紅鳳菜粗提物中總黃酮的靜態(tài)吸附效果有差異，其中D-101、HPD-100大孔樹(shù)脂的吸附量、吸附率、解吸附量均較高，解吸附率與AB-8、NKA大孔樹(shù)脂相近但低于X-5大孔樹(shù)脂。

極性吸附材料聚酰胺的吸附量、吸附率和解吸附量均低于D-101、HPD-100大孔樹(shù)脂，與NKA、X-5、AB-8大孔樹(shù)脂相當(dāng)，解吸附率則低于所有選用的大孔樹(shù)脂。

因此可見(jiàn)，在所測(cè)定的6種層析材料中，D-101、HPD-100大孔樹(shù)脂有較好的靜態(tài)吸附性能，但解吸附率并不突出；X-5大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附效果一般，但解吸附率最高；聚酰胺的靜態(tài)吸附性能一般，解吸附性能最低。

2.3.2不同層析材料的動(dòng)態(tài)吸附篩選試驗(yàn)表3是各種層析材料對(duì)紅鳳菜總黃酮的動(dòng)態(tài)吸附效果，可以看出其吸附情況與靜態(tài)吸附有較大差異。

不同層析材料的對(duì)紅鳳菜總黃酮的動(dòng)態(tài)吸附效果

層析材料類(lèi)型結(jié)構(gòu)特性上柱量

（mg/g）吸附量

（mg/g）解吸附量

（mg/g）解吸附率

（%）NKA大孔樹(shù)脂非極性33272280.5D-101大孔樹(shù)脂非極性31252081.2HPD-100大孔樹(shù)脂非極性31252184.3X-5大孔樹(shù)脂非極性30241979.4AB-8大孔樹(shù)脂弱極性27211675.0聚酰胺極性3322943.4

由結(jié)果可以看出，與5種大孔樹(shù)脂相比，極性較高的吸附材料聚酰胺的上柱量較高，達(dá)33 mg/g；但吸附量低于NKA、HPD-100、D-101和 X-5大孔樹(shù)脂，略高于AB-8大孔樹(shù)脂；而其解吸附量與解吸附率則大大低于所選用的5種大孔吸附樹(shù)脂?？梢?jiàn)對(duì)于紅鳳菜總黃酮來(lái)說(shuō)，聚酰胺的吸附性能尚可，但解吸附能力較差，不宜用于紅鳳菜粗提物中總黃酮的分離。

還可以看出，在所選用的5種大孔吸附樹(shù)脂中，弱極性的AB-8大孔樹(shù)脂對(duì)紅鳳菜粗提物中總黃酮的上柱量、吸附量、解吸附量和解吸附率均低于其他4種非極性大孔樹(shù)脂；而非極性的NKA大孔樹(shù)脂的上柱量、吸附量、解吸附量均最高，解吸附率低于HPD-100大孔樹(shù)脂，與D-101、X-5大孔樹(shù)脂相當(dāng)。

綜合考慮以上動(dòng)態(tài)吸附的指標(biāo)，NKA大孔樹(shù)脂是分離紅鳳菜粗提物中總黃酮的優(yōu)選吸附材料，其他3種非極性大孔樹(shù)脂即D-101、HPD-100、X-5大孔樹(shù)脂也有較好的分離效果。

3討論

研究結(jié)果顯示，紅鳳菜中的黃酮類(lèi)化合物主要是槲皮素、山柰酚及其苷類(lèi)物質(zhì)[2-4]，因此可以采用乙醇-水混合溶劑進(jìn)行提取。裴詠萍等以干燥的紅鳳菜葉片為原料，研究了紅鳳菜總黃酮的提取工藝，結(jié)果表明乙醇濃度對(duì)總黃酮的提取有顯著影響，以70%乙醇提取效果最好[6]。由于紅鳳菜新鮮莖葉含水量高于90%[7]并且莖稈呈肉質(zhì)狀而難以干燥，為了節(jié)省勞力、降低能耗，本試驗(yàn)直接采用新鮮莖葉為原料進(jìn)行提取。通過(guò)比較不同濃度乙醇的提取效果顯示，95%乙醇對(duì)紅鳳菜新鮮莖葉的總黃酮提取效果最佳。endprint

一般認(rèn)為，大孔吸附樹(shù)脂的吸附是依靠樹(shù)脂與化合物之間的范德華引力或形成的氫鍵，聚酰胺的吸附作用是依靠其分子中的酰胺羰基與黃酮類(lèi)化合物的酚羥基形成的氫鍵[5]，大孔樹(shù)脂和聚酰胺均被廣泛應(yīng)用于黃酮類(lèi)化合物的分離和富集。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，被極性吸附材料聚酰胺所吸附的總黃酮的解吸附性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于非極性或弱極性的大孔樹(shù)脂，其原因可能是聚酰胺與黃酮分子間形成了較穩(wěn)定的氫鍵，導(dǎo)致難以解吸附。

雖然在靜態(tài)吸附試驗(yàn)中大孔樹(shù)脂D-101、HPD-100表現(xiàn)出了較好的吸附性能，但在動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)中其吸附性能均低于NKA，說(shuō)明大孔樹(shù)脂D-101、HPD-100吸附的總黃酮容易被水洗脫，而NKA能較牢固地吸附總黃酮。在動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)中，NKA大孔樹(shù)脂既有較好的吸附性能又有較好的解吸附性能。為了有效地分離紅鳳菜粗提物中的總黃酮，并綜合考慮各種材料的吸附效果，應(yīng)優(yōu)先選用NKA大孔樹(shù)脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)柱層析；同時(shí)試驗(yàn)表明，非極性的D-101、HPD-100、X-5大孔樹(shù)脂也有較好的分離效果。

參考文獻(xiàn)：

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一般認(rèn)為，大孔吸附樹(shù)脂的吸附是依靠樹(shù)脂與化合物之間的范德華引力或形成的氫鍵，聚酰胺的吸附作用是依靠其分子中的酰胺羰基與黃酮類(lèi)化合物的酚羥基形成的氫鍵[5]，大孔樹(shù)脂和聚酰胺均被廣泛應(yīng)用于黃酮類(lèi)化合物的分離和富集。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，被極性吸附材料聚酰胺所吸附的總黃酮的解吸附性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于非極性或弱極性的大孔樹(shù)脂，其原因可能是聚酰胺與黃酮分子間形成了較穩(wěn)定的氫鍵，導(dǎo)致難以解吸附。

雖然在靜態(tài)吸附試驗(yàn)中大孔樹(shù)脂D-101、HPD-100表現(xiàn)出了較好的吸附性能，但在動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)中其吸附性能均低于NKA，說(shuō)明大孔樹(shù)脂D-101、HPD-100吸附的總黃酮容易被水洗脫，而NKA能較牢固地吸附總黃酮。在動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)中，NKA大孔樹(shù)脂既有較好的吸附性能又有較好的解吸附性能。為了有效地分離紅鳳菜粗提物中的總黃酮，并綜合考慮各種材料的吸附效果，應(yīng)優(yōu)先選用NKA大孔樹(shù)脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)柱層析；同時(shí)試驗(yàn)表明，非極性的D-101、HPD-100、X-5大孔樹(shù)脂也有較好的分離效果。

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一般認(rèn)為，大孔吸附樹(shù)脂的吸附是依靠樹(shù)脂與化合物之間的范德華引力或形成的氫鍵，聚酰胺的吸附作用是依靠其分子中的酰胺羰基與黃酮類(lèi)化合物的酚羥基形成的氫鍵[5]，大孔樹(shù)脂和聚酰胺均被廣泛應(yīng)用于黃酮類(lèi)化合物的分離和富集。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，被極性吸附材料聚酰胺所吸附的總黃酮的解吸附性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于非極性或弱極性的大孔樹(shù)脂，其原因可能是聚酰胺與黃酮分子間形成了較穩(wěn)定的氫鍵，導(dǎo)致難以解吸附。

雖然在靜態(tài)吸附試驗(yàn)中大孔樹(shù)脂D-101、HPD-100表現(xiàn)出了較好的吸附性能，但在動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)中其吸附性能均低于NKA，說(shuō)明大孔樹(shù)脂D-101、HPD-100吸附的總黃酮容易被水洗脫，而NKA能較牢固地吸附總黃酮。在動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)中，NKA大孔樹(shù)脂既有較好的吸附性能又有較好的解吸附性能。為了有效地分離紅鳳菜粗提物中的總黃酮，并綜合考慮各種材料的吸附效果，應(yīng)優(yōu)先選用NKA大孔樹(shù)脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)柱層析；同時(shí)試驗(yàn)表明，非極性的D-101、HPD-100、X-5大孔樹(shù)脂也有較好的分離效果。

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