鄭 翔，劉興宇，李學(xué)英，吳明松

(遵義醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

ERGIC3主要參與蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的早期運(yùn)輸，近年的研究顯示，ERGIC3在肺癌、肝癌中異常高表達(dá)，還參與肺癌[1]、肝癌[2]的發(fā)生發(fā)展，以及抑制Brefeldin (BFA)誘導(dǎo)的HEK-293細(xì)胞凋亡[3]，然而機(jī)制尚不清楚。大多數(shù)肺癌起源于支氣管上皮細(xì)胞[4]，因此我們構(gòu)建了pLXSN-ERGIC3真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染入支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ERGIC3的支氣管上皮細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究ERGIC3基因在肺癌中的作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 BEAS-2B細(xì)胞、PT-67細(xì)胞由中科院昆明動(dòng)物所曹毅研究員惠贈(zèng)。定量PCR儀機(jī)型為Bio-rad公司產(chǎn)品(型號(hào)：iCycler iQ)。pLXSN載體購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物有限公司，SYB Green購(gòu)自Invitrogen公司，感受態(tài)大腸桿菌DH5α和逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV購(gòu)自Promega公司，Taq酶和ERGIC3多克隆抗體購(gòu)自Sigma公司，β-actin一抗和HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，ECL試劑購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。人肺組織為肺癌患者手術(shù)后20 min內(nèi)取材，立即放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) BEAS-2B細(xì)胞和PT-67細(xì)胞生長(zhǎng)于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d換液，3～5 d傳代，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 參照GenBank的人ERGIC3基因序列(NM_198398.1)，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，P1：5'-GGTGGTGAATTCATGAGGCGCT GGGGAAGCT-3'，P2：5'-GGTGGTGGATCCACCGAGGAGGGTGACTACGTTGT CTT-3'，在引物的5'端分別加上保護(hù)堿基GGTGGT和EcoR I、BamH I的酶切序列。定量PCR引物：ERGIC3: F: 5'-GGAGAGGTACTGAGGACAAATCA-3'，R: 5'-AGCTCATAGAGGACGAAGACTC-3'； β-actin: F: 5'-CGGGAAATCGTG CGTGAC-3'，R: 5'-CAGGA AGGAAGGCTGGAAG-3'。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.4 人ERGIC3基因的擴(kuò)增 用TRIzol試劑提取人肺組織總RNA，以其為模板，隨機(jī)引物為引物，用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV合成cDNA。再以此cDNA為模板，P1、P2為引物，經(jīng) PCR擴(kuò)增得到ERGIC3基因的ORF框DNA片段。反應(yīng)體系：cDNA模板 5 μL，10×緩沖液10 μL，dNTP(10 mM)2 μL，引物P1、P2(10 μM)各2 μL，高保真Taq 酶2 μL，滅菌水補(bǔ)足體積至100 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃ 5 min，然后94℃30 s，58℃ 1min，72℃ 2.5 min，共30個(gè)反應(yīng)循環(huán)。定量PCR以 β-actin 為內(nèi)參，采用2△△CT方法[5]，以3次實(shí)驗(yàn)的平均△CT值計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 RT-PCR產(chǎn)物和pLXSN質(zhì)粒分別經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切，37℃酶切2 h后，瓊脂糖電泳回收目的基因片段和載體片段，稀釋濃度至50 ng/μL。再用T4 DNA連接酶連接，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒后進(jìn)行PCR及雙酶切鑒定，將初步鑒定正確的菌液送華大生物有限公司測(cè)序。構(gòu)建正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pLXSN-ERGIC3，以pLXSN的空載體為對(duì)照組。

1.6 pLXSN-ERGIC3逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝 PT-67細(xì)胞接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，第2天細(xì)胞匯合度在60%～80%，用脂質(zhì)體Lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染pLXSN-ERGIC3質(zhì)粒，48 h后收集病毒上清。室溫低速離心5 min，去除細(xì)胞碎片，收集病毒液，用0.45 μm的醋酸纖維膜過(guò)濾病毒液，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立

1.7.1 pLXSN-ERGIC3病毒顆粒感染BEAS-2B細(xì)胞 BEAS-2B細(xì)胞接種于6孔板中，次日細(xì)胞匯合度在40%～60%，換為含有pLXSN-ERGIC3病毒顆粒的培養(yǎng)液，加入終濃度為6 μg/mL的 Polybrene，24 h后換為正常培養(yǎng)液。

1.7.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選與建立 病毒顆粒感染后48 h，將細(xì)胞1∶5傳代，同時(shí)培養(yǎng)液中加入G418 (終濃度為400 μg/mL)，每3～5天更換含G418的培養(yǎng)液，待長(zhǎng)出克隆后將其挑出，進(jìn)行單克隆化培養(yǎng)。

將上述的克隆挑取幾個(gè)，用有限稀釋法稀釋細(xì)胞懸液，并接種于96孔板中。于第2天和第3天觀察，標(biāo)記只有1個(gè)細(xì)胞的孔。每3～5 天更換含G418的培養(yǎng)液，待長(zhǎng)出克隆后將其消化逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)：96孔板、48孔板、24孔板、6孔板。之后進(jìn)行q-RT-PCR和Western blot鑒定。

1.8 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的鑒定

1.8.1 q-RT-PCR檢測(cè) 收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提取總RNA、逆轉(zhuǎn)錄以及定量PCR等操作見(jiàn)1.4。

1.8.2 Western blot檢測(cè) 收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用適量細(xì)胞裂解液裂解并提取蛋白，BCA法定量蛋白濃度，煮沸變性后，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，4 ℃冰箱孵育一抗(ERGIC3 1∶500，β-actin 1∶10000)過(guò)夜，TBST洗滌，然后室溫孵育HPR標(biāo)記的二抗(1∶2000) 1 h，用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行曝光、顯影。以β-actin作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的劃痕試驗(yàn) 6孔板中加入5×105個(gè)細(xì)胞，過(guò)夜能鋪滿(mǎn)培養(yǎng)板底。第2天用10μL槍頭劃3條線。用PBS洗細(xì)胞3次，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按0、24 h，每孔取相交處拍照。計(jì)算細(xì)胞遷移率。公式為：

2 結(jié)果

2.1 ERGIC3基因擴(kuò)增及表達(dá)載體構(gòu)建 用RT-PCR擴(kuò)增得到ERGIC3基因的ORF DNA片段(見(jiàn)圖1.A，條帶1)為1200 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切、純化后(見(jiàn)圖1B，條帶1)插入到線性化的pLXSN質(zhì)粒中(見(jiàn)圖1B，條帶2)，再轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，并擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒DNA，用EcoR I和BamH I進(jìn)行酶切鑒定，1.5%瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，在約1200 bp處的條帶為ERGIC3的ORF DNA條帶 (見(jiàn)圖1C，條帶1)，初步確定載體構(gòu)建成功。該質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果顯示，DNA序列正確(數(shù)據(jù)未顯示，pLXSN-ERGIC3載體構(gòu)建成功。ERGIC3有2種剪切方式，mRNA分別對(duì)應(yīng)變異體1 (variant 1)和變異體2 (variant 2)。通過(guò)序列比對(duì)，獲得的序列為ERGIC3變異體2。)

M：DNA marker。圖1 重組pLXSN-ERGIC3質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

2.2 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)ERGIC3細(xì)胞株建立 BEAS-2B感染了ERGIC3的逆轉(zhuǎn)錄病毒后，通過(guò)G418篩選、單克隆化后，得到4株穩(wěn)定過(guò)表達(dá)ERGIC3的BEAS-2B細(xì)胞株。其mRNA的表達(dá)水平，分別是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pLXSN空載體的BEAS-2B的45.3、48.8、41.5和28.2倍(見(jiàn)圖2B)。進(jìn)一步的Western blot 結(jié)果也顯示，穩(wěn)定表達(dá)ERGIC3的BEAS-2B細(xì)胞株的ERGIC3蛋白水平明顯高于對(duì)照組(見(jiàn)圖2A)。

pLXSN：空載體；pLXSN-ERGIC3(1)～(4)分別代表穩(wěn)定過(guò)表達(dá)ERGIC3的BEAS-2B細(xì)胞株。 圖2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ERGIC3細(xì)胞株中ERGIC3 mRNA和蛋白表達(dá)量

2.3 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)ERGIC3細(xì)胞株遷移速度及形態(tài)變化 我們選擇了表達(dá)量最高的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行功能試驗(yàn)，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，穩(wěn)定過(guò)表達(dá)ERGIC3細(xì)胞株的細(xì)胞遷移速度明顯增加(P<0.05)(見(jiàn)圖3)，但細(xì)胞呈梭形、多角形等形狀，與對(duì)照組細(xì)胞相比，形態(tài)沒(méi)有明顯變化(見(jiàn)圖4)。

圖3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ERGIC3細(xì)胞株的遷移能力(*P<0.05)

圖4 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)ERGIC3細(xì)胞株的形態(tài)

3 討論

人ERGIC3 (endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment protein 3)屬于II型跨膜蛋白，也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體間的循環(huán)蛋白[6-7]，由383個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為43.2 kDa。本研究發(fā)現(xiàn)，支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B穩(wěn)定過(guò)表達(dá)后，細(xì)胞有一定的惡變傾向，表現(xiàn)為其遷移能力增加，而癌細(xì)胞遷移能力是癌細(xì)胞擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的前提條件，因此，ERGIC3穩(wěn)定過(guò)表支氣管上皮細(xì)胞株可以作為肺癌轉(zhuǎn)移的較好的細(xì)胞模型。

建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法很多，其關(guān)鍵是基因插入細(xì)胞的基因組中。其方法主要有脂質(zhì)體介導(dǎo)法，病毒感染法等，后者又分為逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒2種方式。脂質(zhì)體介導(dǎo)法的最大不足在于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后目標(biāo)基因在基因組整合概率低，而慢病毒需要多種包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染，逆轉(zhuǎn)錄病毒能感染難轉(zhuǎn)染細(xì)胞并且效率高、易于插入到基因組轉(zhuǎn)錄活性較高的部位。因此，本研究采用逆轉(zhuǎn)錄感染細(xì)胞的方法。選擇支氣管上皮細(xì)胞，原因之一是肺癌大多起源于支氣管上皮細(xì)胞[4, 8]，原因之二是正常支氣管上皮細(xì)胞中ERGIC3的表達(dá)水平很低，而87%肺癌患者的ERGIC3表達(dá)水平上調(diào)[1]。本研究結(jié)果表明，ERGIC3在支氣管上皮細(xì)胞過(guò)表達(dá)后，細(xì)胞的遷移能力明顯增加，提示ERGIC3在肺癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要作用，而腫瘤轉(zhuǎn)移一直是腫瘤的最核心的問(wèn)題[9-10]，大多數(shù)癌癥患者死于癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。ERGIC3可能不是通過(guò)EMT的機(jī)制促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移能力的，因ERGIC3轉(zhuǎn)染入BEAS-2B細(xì)胞后，其形態(tài)學(xué)沒(méi)有明顯變化，未形成典型的間充質(zhì)樣細(xì)胞形態(tài)。至于ERGIC3在體內(nèi)是否參與了肺癌細(xì)胞的MET過(guò)程，還需進(jìn)一步研究。ERGIC3促進(jìn)細(xì)胞遷移的機(jī)制可能是：①ERGIC3通常和另一個(gè)與之高度同源的蛋白Erv41結(jié)合形成異二聚體而發(fā)揮生物學(xué)功能[11-12]，參與加強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新合成的參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的蛋白質(zhì)的運(yùn)輸，增加細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力；②mi490p以ERGIC3為靶點(diǎn)促進(jìn)肺癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，但是，其具體的機(jī)制尚不清楚。對(duì)ERGIC3的生物學(xué)功能研究，近年才剛剛開(kāi)始，隨著對(duì)ERGIC3的認(rèn)識(shí)的深入，也許會(huì)有重要的發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，本研究獲得的人ERGIC3基因穩(wěn)定表達(dá)支氣管上皮細(xì)胞株可以作為肺癌轉(zhuǎn)移的較好的細(xì)胞模型，為研究ERGIC3在肺癌中的病理生理功能提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也為研究ERGIC3的細(xì)胞生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)。

致謝：本工作得到曹毅先生的指導(dǎo)，特此感謝。

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