王青青， 張 媛， 章 鈞， 郝秀蘭， 侯紅瑛

(中山大學附屬第三醫(yī)院婦產科，廣東 廣州 510630)

利用母血漿中胎兒游離DNA，對胎兒單基因遺傳病進行無創(chuàng)性產前診斷，是目前產前診斷領域中的研究熱點。但是，胎兒游離DNA存在于一個大的母體背景DNA中，在妊娠母體外周血中含量非常少，是目前產前診斷領域研究所面臨的一個瓶頸問題。為解決這一瓶頸問題， 2008年Li等[1]首次報道了低變性溫度共擴增PCR(co-amplicationatlowerdenaturationtemperaturePCR，COLD-PCR)技術，其可以在大量野生型基因背景中優(yōu)先擴增少量突變基因，為利用母血漿胎兒游離DNA進行無創(chuàng)性產前診斷單基因遺傳病提供了新的技術；2012年Castellanos-Rizaldos等[2]在COLD-PCR技術基礎上進行了改進，首次報道了耐受溫度-低變性溫度共擴增PCR(temperature-tolerantco-amplicationatlowerdenaturationtemperaturePCR，TT-COLD-PCR)技術，降低了COLD-PCR的實驗難度，使COLD-PCR技術更有利于用于臨床。該技術共包括2種形式：快速耐受溫度-低變性溫度共擴增PCR(temperature-tolerantfastCOLD-PCR,TT-FAST-COLD-PCR)技術及完全耐受溫度-低變性溫度共擴增PCR(temperature-tolerantfullCOLD-PCR，TT-FULL-COLD-PCR)技術[1]，目前該技術僅被用于富集外周血中腫瘤來源的游離DNA突變，在無創(chuàng)性產前診斷方面的應用尚無報道[3]。

本研究以廣東地區(qū)最常見的單基因遺傳病β地中海貧血IVS-II-654型及CD41-42型作為切入點進行研究，通過檢測母血漿中胎兒游離DNA突變，擬建立一種簡便、高效的可富集母血漿中胎兒游離DNA突變的實驗平臺，評價其在母血漿中富集、鑒定胎兒游離DNA突變的適用范圍。

材 料 和 方 法

1 材 料

1.1臨床資料 第一階段選取2012年3月～2012年9月就診于中山大學附屬第三醫(yī)院產科門診及產科實驗室的20例β地中海貧血(其中IVS-II-654型9例及CD41-42型11例)患者外周血標本；第二階段選取2012年3月～2013年2月就診于中山大學附屬第三醫(yī)院產科實驗室的4對均為β地中海貧血的夫婦外周血標本，見表1；所有外周血標本均使用血常規(guī)管(EDTA抗凝)，抽取數量為8mL；夫婦雙方β地中海貧血基因類型均于我院產科實驗室通過基因測序技術確診。本研究嚴格按照中國醫(yī)學倫理委員會的要求，已征得所有研究對象的知情同意，并均已簽署知情同意書。

表1 4例夫婦雙方β地中海貧血基因類型

1.2羊水細胞培養(yǎng)結果對照 對上述4例孕婦，于抽血前實施羊膜腔穿刺術抽取羊水細胞標本，所有羊水細胞標本基因類型均通過基因測序技術確診，胎兒基因型以此檢測結果作為金標準進行對照。

2 方法

2.1外周血DNA的提取 取EDTA抗凝的外周血2mL，混勻后取200μL用于提取DNA。采用QIAampDNAMiniKit(Qiagen)，按照說明書操作提取DNA。使用pH為8.0的TE緩沖液將DNA稀釋至終濃度為100mg/L。

2.2單核苷酸多態(tài)性位點 使用Haploview軟件，對HBB基因進行SNP與單倍型分析，檢索HBB基因內雜合度較高的SNP位點；檢測收集樣本中與IVS-II-654位點及CD-41-42位點連鎖的SNP位點。

2.3TT-COLD-PCR技術 引物序列信息見表2。本研究所選試劑均由Invitrogen公司提供，總反應體系為25μL：2.5μL10×PCRBuffer(不含Mg2+)；0.75μLMgCl2；1.0μLPCR引物(0.4μmol/L)；1.5μLDNA模板；18.55μLddH2O；0.2μLPlatimumTapDNAPolymerase。

表2 TT-COLD-PCR引物序列

2.4父源性β地貧為IVS-II-654型及CD41-42型分析 孕婦外周血分別利用 TT-FAST-COLD-PCR及TT-FULL-COLD-PCR技術，其反應循環(huán)條件分別如下： (1)95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s；循環(huán)25次；75.7 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s；76.0 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s；76.3 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s；76.6 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s；76.9 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s；70 ℃延伸7 min；產物于4 ℃條件下保存。(2)95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；循環(huán)25次；95 ℃變性30 s；70 ℃復性5 min；83.5 ℃變性3 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；95 ℃變性30 s；70 ℃復性5 min；84.0 ℃變性3 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；95 ℃變性30 s；70 ℃復性5 min；84.5 ℃變性3 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；95 ℃變性30 s；70 ℃復性5 min；85.0 ℃變性3 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；95 ℃變性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸7 min；產物于4 ℃條件下保存。擴增后的產物送上海英俊生物技術有限公司測序。

2.5普通PCR技術 引物序列同TT-COLD-PCR技術。反應體系配置同TT-COLD-PCR技術。反應循環(huán)條件：95 ℃預變性5min；95 ℃變性30s，60 ℃退火30s，72 ℃退火30s；循環(huán)40次；72 ℃延伸7min；產物于4 ℃條件下保存。擴增后的產物送上海英俊生物技術有限公司測序。

結 果

1 單核苷酸多態(tài)性位點

在本研究中對收集的20例β地貧患者進行測序，結果發(fā)現9例IVS-II-654型β地中海貧血與rs7480526位點連鎖，11例CD41-42型β地中海貧血與rs10768683位點連鎖：圖1A表示與IVS-II-654位點連鎖的SNP位點rs7480526，其堿基類型為A/C；圖1B與圖1C表示SNP位點rs7480526中A堿基與野生型IVS-II-654位點G堿基連鎖；圖1D與圖1E表示SNP位點rs7480526中C堿基與突變型IVS-II-654位點A堿基連鎖；圖2A表示與CD41-42位點連鎖的SNP位點rs10768683，其堿基類型為G/C；圖2B與圖2C表示SNP位點rs10768683中G堿基與野生型CD41-42位點TTCT四個堿基連鎖；圖2D與圖2E表示SNP位點rs107686831中C堿基與突變型CD41-42位點堿基連鎖(其中，黑色箭頭表示CD41-42發(fā)生移碼突變的位置)。

2 TT-FAST-COLD-PCR、TT-FULL-COLD-PCR及普通PCR技術檢測4例孕婦外周血標本

利用TT-FAST-COLD-PCR技術檢測父源性β地中海貧血基因類型為IVS-II-654型的2例孕婦外周血標本，其中1例可明顯擴增出父源性致病突變基因(A堿基)，見圖3；另外1例未直接檢測到父源性致病突變基因，但檢測到與其連鎖的rs7480526位點(C堿基)，與羊水細胞培養(yǎng)檢測結果一致，檢出率為100%。利用TT-FULL-COLD-PCR技術檢測父源性β地中海貧血基因類型為CD41-42的2例孕婦外周血標本，均可明顯擴增出父源性致病突變基因(以擴增出發(fā)生移碼突變后的堿基序列作為依據)，見圖4。AGG 3個堿基為發(fā)生TTCT移碼突變后最先擴增到的3個堿基序列，與羊水細胞培養(yǎng)檢測結果一致，檢出率為100%。利用普通PCR技術檢測父源性β地中海貧血基因類型為IVS-II-654型的2例孕婦外周血標本，只檢測到IVS-II-654野生型位點，未檢測到其突變型位點，見圖5。利用普通PCR技術檢測父源性β地中海貧血基因類型為CD41-42的2例孕婦外周血標本，只檢測到CD41-42野生型位點，未檢測到其突變型位點，見圖6。

3 金標準對照

圖7為利用羊水細胞培養(yǎng)標本通過測序檢測出胎兒1及胎兒2的β地中海貧血基因類型(IVS-II-654型)，其堿基突變類型為G堿基突變?yōu)锳堿基；圖8為胎兒3及胎兒4的β地中海貧血基因類型(CD41-42型)，其堿基突變類型為TTCT 4個堿基缺失導致的移碼突變。

Figure 1. The SNP was associated with IVS-II-654. a: the SNP rs7480526 (A/C). Black arrow: A base; blue arrow: C base. b: the SNP rs7480526 (A) was linked to the wild type of IVS-II-654. Black arrow: A base. c: the wild type of IVS-II-654 was linked to the rs7480526 (A). Red arrow: G base. d: the SNP rs7480526 (C) was linked to the mutant type of IVS-II-654. Black arrow: C base. e: the mutant type of IVS-II-654 was linked to the rs7480526(C). Red arrow: A base.

討 論

1997年香港中文大學Lo等[4]首次證實了母體血漿中胎兒游離DNA的存在，為無創(chuàng)性產前診斷開辟了新的途徑。利用母血漿胎兒游離DNA無創(chuàng)性產前診斷胎兒單基因遺傳病是目前產前診斷領域的研究熱點；然而，由于母血漿中胎兒游離DNA含量相對很少，母源性游離DNA占絕對優(yōu)勢，利用傳統(tǒng)的PCR技術則會干擾胎兒來源游離DNA的擴增，因此難以準確對胎兒單基因遺傳病進行無創(chuàng)性產前診斷，這是當前研究所面臨的瓶頸問題。

2008年，Li等[1]首次報道了COLD-PCR技術，該技術利用異源雙鏈與同源雙鏈之間變性溫度的差異，可以在大量野生型基因背景中優(yōu)先富集特定類型的少量DNA突變；由于對異源雙鏈臨界變性溫度(critical denaturation temperature，Tc)值的要求較高，在實驗中需要對各種等位基因解鏈溫度(melting temperature，Tm)值測定的基礎上反復優(yōu)化實驗條件才能確定，反應體系的配置、PCR擴增儀孔間試劑溫度、PCR儀溫度上升的速度等[2]都會對其造成影響，因此增加了實驗難度。2012年Castellanos-Rizaldos等[2]在COLD-PCR技術基礎上進行了改良，首次報道了TT-COLD-PCR技術，其根據堿基突變或缺失類型，將異源雙鏈的變性溫度限制于一個特定溫度范圍內，在此溫度范圍內進行PCR擴增時會大大提高擴增效率并降低實驗難度。

Figure 2. The SNP was associated with CD41-42. a: the SNP rs10768683 (G/C). Black arrow: G base; red arrow: C base. b: the SNP rs10768683 (G) was linked to the wild type of CD41-42. Red arrow: G base. c: the wild type of CD41-42 was linked to the rs10768683 (G). Black arrow: TTCT bases. d: the SNP rs10768683 (C) was linked to the mutant type of CD41-42. Red arrow: C base. e: the mutant type of CD41-42 was linked to the rs10768683 (C). Black arrow: the location of the frame shift mutations (TTCT).

Figure 3. TT-FAST-COLD-PCR thermocycling program enriched mutations in IVS-II-654 (G>A) in HBB gene. Red arrow： G base was the wild type of IVS-II-654; black arrow: A base was the mutant type of IVS-II-654.

Figure 4. TT-FULL-COLD-PCR thermocycing program enriched mutations in CD41-42 (ΔTTCT) in HBB gene . Black arrow: the TTCT four bases were the wild type of CD41-42; red arrow: the AGG bases were the firstly amplified three bases when the TTCT bases were missed.

Figure 5. Conventional-PCR thermocycling program enriched mutations in IVS-II-654 (G>A) in HBB gene . Red arrow: G base was the wild type of IVS-II-654.

Figure 6. Conventional-PCR thermocycling program enriched mutations in CD41-42 (ΔTCTT ) in HBB gene .Black arrow: the TTCT four bases were the wild type of CD41-42.

Figure 7. The fetal gene type of β-thalassemia of the first and second cases.Black arrow: A base was the mutant type of IVS-II-654.

Figure 8. The fetal gene type of thalassemia of the third and fourth cases. Black arrow: the location of the frame shift mutations (TTCT) was the mutant type of CD41-42.

該技術共包括2種形式，分別為TT-FAST-COLD-PCR技術及TT-FULL-COLD-PCR技術,其中，TT-FAST-COLD-PCR技術只適用于當點突變(例如：G∶C>A∶T或者G∶C>T∶A)導致DNA雙鏈Tm值降低時，對于點突變或者堿基缺失導致DNA雙鏈Tm值無變化或者升高，則不能利用此技術進行擴增；TT-FULL-COLD-PCR技術適用于擴增對于堿基突變導致DNA雙鏈的Tm值降低、不變或者升高的類型，具有可以擴增所有已知突變及未知突變的優(yōu)點；但是，由于在TT-FULL-COLD-PCR技術中增加了異源雙鏈形成溫度這一步驟，故PCR循環(huán)時間較長[5]，對DNA聚合酶的影響較大，使富集效果受到影響；與TT-FULL-COLD-PCR相比，時間更快且擴增效率更高。

目前國內外報道的關于無創(chuàng)性產前診斷單基因遺傳病的技術或方法包括凝膠電泳大小分離法、全基因組擴增法[6]和肽核酸鉗技術[7]等均分別存在靈敏度差、通用性差、成本高和無法在臨床上推廣等局限性。本研究以本地區(qū)最常見的單基因遺傳病β地貧(IVS-II-654型及CD41-42型)的無創(chuàng)性產前診斷作為切入點，選取夫婦雙方為不同β地貧血基因類型的病例進行研究：由于IVS-II-654型β地貧點突變類型為C>T或G>A，突變型DNA雙鏈的Tm值小于野生型DNA雙鏈的Tm值，而CD41-42型β地貧突變類型為TCTT或者TTCT4個堿基缺失導致的移碼突變，突變型DNA雙鏈的Tm值大于野生型DNA雙鏈的Tm值，而根據不同形式TT-COLD-PCR技術原理：對于父源性β地貧基因類型為IVS-II-654者，利用TT-FAST-COLD-PCR技術，其中1例直接予孕婦外周血中直接擴增出父源性β地貧致病突變基因，而另外1例未直接擴增出父源性β地貧致病突變基因，對于此病例，本研究則選擇擴增與父源性β地貧基因連鎖的SNP位點的方法，來降低檢測的陰性率；對于父源性β地中海貧血基因類型為CD41-42型者，我們則利用TT-FULL-COLD-PCR技術對孕婦外周血中胎兒游離DNA進行擴增，直接擴增出了父源性β地中海貧血基因，表示胎兒遺傳了父源性β地貧致病突變基因，具有介入性產前診斷指征。利用SNPs進行無創(chuàng)性產前診斷具有以下優(yōu)點：(1)在孕婦外周血中若未直接檢測到父源性致病突變基因，則可以通過檢測與父源性等位基因連鎖的SNP位點，降低檢測陰性率；(2)如果夫婦雙方均具有相同等位基因時，可以利用夫婦雙方具有不同的SNPs來進行區(qū)分；(3)檢測結果可以使用SNPs來進行進一步確認。對于父源性致病突變基因及與父源性等位基因連鎖的SNP位點均未擴增出者，則代表胎兒未遺傳父源性致病突變基因，對于這一部分孕婦，則免受介入性產前診斷的痛苦，從而降低了介入性產前診斷的比例。

為了觀察TT-COLD-PCR技術對少量突變基因的擴增效率，我們同時對上述標本進行了普通PCR技術擴增，擴增后產物測序結果表明：利用TT-FAST-COLD-PCR技術可以優(yōu)先、有效富集IVS-II-654型少量突變基因，其富集效率可提高10～15倍左右；利用TT-FULL-COLD-PCR技術可以優(yōu)先、有效富集CD41-42型少量突變基因，富集效率可提高2～5倍。

綜上所述，本研究建立了一種簡便、高效的可富集母血漿中胎兒游離DNA突變的實驗平臺，并且利用同時檢測父源性致病突變基因及與父源性等位基因連鎖的SNP位點的方法[8]，拓展了檢測范圍從而降低了檢測的假陰性率，可用于無創(chuàng)性產前診斷單基因遺傳病。

[參 考 文 獻]

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