方海洋， 陳 琦， 項 建， 吳延慶， 程曉曙

(南昌大學第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江西 南昌 330006)

熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是一類應激蛋白，因其與熱應激有關故冠名HSPs，它們屬于進化上較為保守的蛋白家族。 HSP22為一種絲/蘇氨酸激酶，分子量21.6 kD，又稱為HSPB8和H11，屬于小HSP家族成員，廣泛分布于哺乳動物的各種組織中，尤其是肌肉相關性組織[1]。早期研究表明高脂環(huán)境刺激下內(nèi)皮細胞HSP70的表達明顯升高，并證明對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)有保護作用[2]。Ghayour-Mobarhan等[3]發(fā)現(xiàn)他汀可以降低脂質(zhì)代謝紊亂患者HSP60、HSP65和HSP70抗體滴度，可能與他汀調(diào)脂外的抗炎及免疫調(diào)節(jié)等保護作用有關。最近有報道他汀可使高脂血癥小鼠血清HSP70抗體滴度降低而使HSP90抗體滴度升高[4]。高脂環(huán)境下動脈HSP的表達究竟如何，因HSP家族成員眾多，且實驗條件均不可能完全相同，尚無統(tǒng)一定論。目前HSP22與高脂血癥的研究甚少，高脂血癥環(huán)境下HSP22的表達如何尚不明確，他汀的干預下，HSP22的表達情況亦不清楚。本研究通過復制高脂血癥大鼠模型，主要探究高脂血癥時大鼠主動脈HSP22的表達，同時觀察高脂血癥時內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)及腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的表達和阿托伐他汀干預對其的影響。

材 料 和 方 法

1 動物與材料

18只7周齡、體重180～210 g的SPF級雄性SD大鼠(實驗動物合格證號為0109526)及高脂飼料(配方：1%膽固醇、5%蛋黃粉、10%豬油、0.2%膽鹽、5%砂糖、0.1%丙基硫氧嘧啶和78.7%基礎飼料)由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。HSP22 Ⅰ抗購于Abnova；TNF-α Ⅰ抗購于Abcam；eNOSⅠ抗購于Signalway Antibody；阿托伐他汀鈣片購于北京嘉林藥業(yè)股份有限公司；維生素D3注射液購于上海通用藥業(yè)股份公司；甘油三酯(triglyceride，TG)試劑盒和總膽固醇(total cholesterol，TC)試劑盒均購自浙江伊利康生物技術(shù)公司；低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)試劑盒和高密度脂蛋白試膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)劑盒均購自北京北化康泰臨床試劑公司；免疫組化試劑盒購自博士德生物技術(shù)公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天生物科技研究所。

2 主要方法

2.1高脂血癥模型的建立及實驗分組 將上述18只SD大鼠適應性喂養(yǎng)7 d，禁食不禁水12 h，眼眶后靜脈叢采血1 mL左右，制備血清，參照試劑盒方法測定大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平觀察其基礎值；18只大鼠隨機分為正常對照組4只和模型組14只，正常對照組給予基礎飼料，模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)，同時按照7×105U/kg體重的劑量腹腔注射維生素D3注射液(分3 d注射，1次/d)[5]，連續(xù)喂飼10周，于末次喂飼后禁食不禁水12 h，再次測定大鼠血脂水平并與造模前的血脂結(jié)果比較，確定是否建成高脂血癥模型。造模成功后模型組大鼠隨機分為高脂對照組8只和他汀干預組6只。正常對照組繼續(xù)喂飼基礎飼料，高脂對照組喂飼高脂飼料，他汀干預組則在喂飼高脂飼料基礎上，同時給予阿托伐他汀2 mg/kg灌胃，其它各組則給予同體積生理鹽水灌胃。各組均連續(xù)喂飼及灌胃21周。干預結(jié)束后，3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射全身麻醉，腹主動脈取血，離心分離血清，一部分用于檢測血脂水平，一部分-80 ℃留存?zhèn)溆谩Ｈ⊙笱杆僬〈笫笾鲃用}，一半于4%多聚甲醛固定，一半液氮速凍。

2.2主動脈組織切片制作及HE染色 經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h的主動脈組織，經(jīng)修塊、流水沖洗、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后，每條主動脈行4 μm厚連續(xù)石蠟切片5張，2張用于HE染色，選擇染色較好的用Olympus BX41顯微鏡拍照。余下3張用于免疫組織化學染色。

2.3免疫組織化學染色 參照試劑盒方法步驟檢測大鼠主動脈HSP22、TNF-α的表達。HSP22 Ⅰ抗?jié)舛葹?∶200，TNF-αⅠ抗?jié)舛葹?∶200。陽性染色為明顯高于背景的棕黃色染色。根據(jù)以下標準將陽性染色分為4級：-：無明顯高于背景的棕黃色染色；+：陽性染色少于10%；++：介于弱陽性與強陽性標準之間；+++：陽性染色60%以上。染色較好的用OlympusBX41顯微鏡拍照。

2.4免疫印跡法檢測eNOS的表達 從液氮中取出主動脈經(jīng)勻漿后，經(jīng)BCA法蛋白定量，取相同數(shù)量的蛋白樣品進行SDS-PAGE，并電轉(zhuǎn)移至NC膜上。用5%脫脂奶粉(用PBS稀釋)室溫封閉30 min，分別滴加1∶500工作濃度的兔抗鼠Ⅰ抗eNOS或GAPDH抗體4 ℃孵育膜過夜。1∶5 000羊抗兔Ⅱ抗37 ℃反應1 h，洗膜后用WO-9413B型凝膠成像系統(tǒng)自帶Gelpro32軟件分析數(shù)據(jù)。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較若方差齊用方差分析，方差不齊用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 一般情況及血脂水平

高脂飼料喂飼后，模型組大鼠出現(xiàn)拒食，先后有3只大鼠死亡。高脂飼料誘導10周后，與正常對照組比較，高脂模型組大鼠血清TC和LDL-C水平均明顯升高，升高幅度分別為正常對照組的1.6倍(3.54±0.33vs2.15±0.33，P<0.05)和1.9倍(1.98±0.18vs1.03±0.30，P<0.05)，而血清TG與HDL-C水平無顯著變化，形成了高膽固醇血癥。

他汀干預期間，高脂對照組大鼠先后有2只大鼠分別于第14周和第20周處死用于觀察大鼠主動脈病變程度，他汀干預組大鼠有1只死亡。至他汀干預結(jié)束時，血清TC和LDL-C水平：高脂對照組分別為正常對照組5.2倍(P<0.01)和8.0倍(P<0.01)；他汀干預組分別為正常對照組3.6倍(P<0.01)和5.8倍(P<0.01)，均顯著低于高脂對照組。血清TG水平：與正常對照組相比高脂對照組及他汀干預組均無明顯升高(P>0.05)。血清HDL-C水平：他汀干預組為正常對照組的2.1倍(P<0.05)；高脂對照組為正常對照組的1.9倍(P<0.05)。他汀干預組與高脂對照組相比無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 阿托伐他汀干預前及干預14周和21周大鼠血脂情況

*P<0.05，**P<0.01vsnormal control；##P<0.01vsHF (high fat).

2 大鼠主動脈病理變化

阿托伐他汀干預21周后，處死所有大鼠。正常對照組大鼠主動脈鏡下均未見病理改變，見圖1A。高脂對照組大鼠主動脈管腔明顯不規(guī)則，管壁厚薄不均，內(nèi)膜部分破壞，中膜層排列紊亂，彈性纖維結(jié)構(gòu)不清，可見明顯鈣化病變，未見脂質(zhì)沉積和泡沫細胞聚集，部分可見軟骨樣細胞增生，見圖1B箭頭所示。他汀干預組大鼠主動脈管腔不規(guī)則，管壁厚薄不均，內(nèi)膜、中膜見明顯鈣化，彈性纖維結(jié)構(gòu)明顯不清，與高脂對照組比較略有改善，見圖1C。模型觀察大鼠于第14周處死后觀察主動脈病理變化，無典型動脈粥樣硬化改變(圖1D)，故各組繼續(xù)按原方案進行。

3 主動脈HSP22的表達

正常對照組大鼠胸主動脈管壁均未見HSP22陽性表達，見圖2A；高脂對照組大鼠胸主動脈管壁可見呈線狀或點狀分布的棕黃色陽性著色，主要較集中分布在中膜，部分散在分布于內(nèi)膜，見圖2B箭頭所示；他汀干預組大鼠胸主動脈管壁可見呈線狀分布的棕黃色陽性著色，主要位于中膜，棕黃色著色較高脂對照組稍淺，見圖2C箭頭所示。他汀干預組平均吸光度值明顯低于高脂對照組(0.211±0.014vs0.345±0.042，P<0.05)，見圖2D。

Figure 1. Representative sections of HE staining of rat aortas(×200).A: normal control group (20 weeks)； B： HF group (20 weeks);C: HF+ATV group (20 weeks);D: HF observation rat (14 weeks).

Figure 2. The expression of HSP22 protein in the aorta of rats (immunohistochemistry, ×400). A: normal control group; B: HF group; C: HF+ATV group; D: statistical bar graph indicates the result of mean optical density of positive particles in each group.Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs HF.

4 主動脈TNF-α的表達

正常對照組大鼠胸主動脈中膜和內(nèi)膜未見TNF-α陽性表達，外膜可見棕黃色著色，見圖3A；高脂對照組大鼠胸主動脈外膜可見棕黃色著色，同時中膜、內(nèi)膜可見呈線狀或點狀分布的棕黃色陽性著色，見圖3B箭頭所示；他汀干預組大鼠胸主動脈外膜可見棕黃色著色，同時中膜、內(nèi)膜可見呈線狀或點狀分布的棕黃色陽性著色，見圖3C箭頭所示。他汀干預組平均吸光度值明顯低于高脂對照組(0.218±0.090vs0.377±0.094，P<0.05)，見圖3D。

Figure 3. The expression of TNF-α protein in the aorta of rats (immunohistochemistry, ×400).A: normal control group; B: HF group; C: HF+ATV group; D: statistical bar graph indicates the result of mean density of positive particles in each group.Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs HF.

5 主動脈eNOS的表達

經(jīng)高脂飲食干預后大鼠主動脈eNOS的表達較正常對照組明顯降低(0.968±0.168vs0.126±0.130，P<0.01)，形成高脂血癥后給予阿托伐他汀干預21周，他汀干預組大鼠主動脈eNOS的表達仍明顯低于正常對照組(0.968±0.168vs0.202±0.177，P<0.01)，他汀干預組eNOS表達水平略高于高脂對照組，但差異無顯著(P>0.05)，見圖4。

Figure 4. The expression of eNOS protein in the aorta of rats.Mean±SD.n=4. *P<0.05 vs normal control.

討 論

動脈是構(gòu)成循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分，并在一系列應激反應如局部的損傷、毒物、吸煙和高脂血癥形成過程中不斷變化，這些刺激直接或間接導致血壓升高和血管壁的損傷，并可進一步導致血管僵硬度增加和形成動脈硬化，機體為了在各種應激條件下存活，為了維持血管壁的穩(wěn)態(tài)，內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞等血管壁細胞會產(chǎn)生大量的HSP而對抗應激狀態(tài)下的血管損傷[6-7]。新近研究發(fā)現(xiàn)人內(nèi)皮細胞在高脂血癥患者血清刺激下形成了內(nèi)皮源性泡沫細胞，并出現(xiàn)HSP27、HSP70和HSP90高表達[8]。

目前，尚未發(fā)現(xiàn)HSP22與高脂血癥的相關研究。本研究中我們參考前人的經(jīng)驗[5]成功復制出高脂血癥大鼠模型，發(fā)現(xiàn)高脂血癥大鼠主動脈HSP22的表達較正常對照組高，與其它HSP成員如HSP27、HSP70在高脂環(huán)境下表達升高呈一致的現(xiàn)象[8]。同時，高脂血癥大鼠主動脈TNF-α的表達較正常對照組高，eNOS的表達則較正常對照組低。TNF-α表達水平上調(diào)可導致血管內(nèi)皮細胞的功能損害而下調(diào)eNOS的表達[9]。TNF-α可誘導血管平滑肌細胞轉(zhuǎn)化、遷移、增殖和凋亡，而這些改變在血管損傷的形成和進展中均起著關鍵作用[10-11]。而本研究HE染色結(jié)果顯示高脂血癥大鼠主動脈管腔明顯不規(guī)則，管壁厚薄不均，內(nèi)膜部分破壞，中膜層排列紊亂，彈性纖維結(jié)構(gòu)不清，可見明顯鈣化病變，呈現(xiàn)出明顯的血管損傷改變。推測HSP22表達的升高很可能是一種對血管損傷的炎癥性刺激的保護性反應，需進一步研究以證實。

阿托伐他汀目前廣泛應用于高膽固醇血癥、冠心病的預防和治療，是膽固醇合成限速酶羥甲基-戊二酸單酰輔酶還原酶抑制劑，能明顯降低心血管死亡[12]。他汀類藥物除有效調(diào)脂作用外，還具有抑制炎癥反應，抗氧化應激，降低血小板活性及改善內(nèi)皮功能等多重調(diào)脂外作用[13]。本研究中阿托伐他汀干預后血脂的變化與他汀類藥物主要降低LDL-C和TC水平，輕度升高HDL-C水平的作用相一致。

阿托伐他汀干預后，大鼠主動脈HSP22的表達較高脂對照組明顯降低。Ghayour-Mobarhan等[3]發(fā)現(xiàn)辛伐他汀和阿托伐他汀都可降低脂質(zhì)代謝紊亂患者血清熱休克蛋白60、65、70抗體滴度。同時血清C-反應蛋白(C-reactive protein,CRP)濃度也均明顯降低，但他汀對HSP抗體滴度的影響與CRP濃度的改變并不具有相關性，提示他汀使HSP抗體滴度降低的作用并不能完全以其抗炎癥反應進行解釋，而可能存在其它的免疫相關調(diào)節(jié)機制。本研究中，阿托伐他汀干預后TNF-α的表達較高脂對照組明顯降低，eNOS的表達則略有升高，表明阿托伐他汀干預后血管炎癥反應已有所抑制，但內(nèi)皮功能尚未能完全恢復。Zhang等[14]進行的研究中阿托伐他汀干預組自實驗開始即給予他汀，共干預30 d，大鼠主動脈eNOS表達明顯較高脂組高(P<0.05)，與正常對照組無明顯差異，血管內(nèi)皮功能明顯恢復。而本研究則是形成明顯高脂血癥后再行阿托伐他汀干預，未能明顯恢復血管內(nèi)皮功能。HE結(jié)果顯示他汀干預組與高脂對照組的差異并不十分顯著，他汀干預組依然存在明顯的血管損傷，這與eNOS的表達未見明顯升高呈一致表現(xiàn)，如能早期進行他汀干預，可能更好地保護血管內(nèi)皮功能。阿托伐他汀是否通過HSP22途徑抑制血管炎癥，恢復內(nèi)皮功能，本研究尚不能闡明。在內(nèi)皮功能尚未完全恢復下，阿托伐他汀干預后HSP22及TNF-α的表達均降低，通過何種機制實現(xiàn)的亦有待進一步探索。

本研究屬于觀察性探索，首次發(fā)現(xiàn)高脂血癥大鼠主動脈HSP22表達升高，阿托伐他汀的干預可降低HSP22的表達。本研究的對象為SD大鼠，形成的高脂血癥中TG水平變化不明顯，分析可能與外源性TG攝取后在血液中主要以乳糜微粒形式存在、代謝較快有關。參照前人的造模方法成功復制高脂血癥模型，但未形成典型的動脈粥樣硬化病變，大鼠動脈硬化以血管的鈣化病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)，形成了Monckeberg型動脈硬化，研究提示大劑量的維生素D3可能通過誘導平滑肌細胞氧化應激，加速平滑肌細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化等復雜機制促進血管鈣化病變形成[15]。本研究中主動脈HSP22及TNF-α的陽性表達均成線狀或點狀分布，具體機制尚不明確，分析可能與血管鈣化病變形成，管壁中正常的細胞被鈣化物質(zhì)取代有關。故后續(xù)進行HSP22在高脂血癥中的具體機制研究時需進一步完善研究方案，減少可能的干擾因素。所選用的動物數(shù)量偏少，可能對實驗結(jié)果有一定影響。

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