鐘 睿，甘 藝，任秀梅，許 琴，趙彥斌，劉 冰，孫兆增，朱宇旌，欒新紅，胡仲明，張 勇，曾 林

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽 110866；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗動物中心，北京 100071；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

比格犬廣泛的應(yīng)用于各種醫(yī)學(xué)科研, 是國內(nèi)外公認(rèn)的實(shí)驗犬[1]。本實(shí)驗室對比格犬的生殖生理進(jìn)行了一定的基礎(chǔ)研究[2]。但近期其種群中出現(xiàn)了不發(fā)情、休情期延長等情況，影響了這一種群的繁衍，也影響了實(shí)驗動物的生產(chǎn)供應(yīng)。動物發(fā)情主要受下丘腦、垂體以及激素調(diào)控，而雌激素又在調(diào)節(jié)過程中起著重要作用，因此研究雌激素在發(fā)情周期中的變化情況就顯得舉足輕重了。發(fā)情周期分為發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期和間情期，然而本實(shí)驗組旨在探究ERβ基因在發(fā)情周期中的變化情況，并不是要細(xì)化各個發(fā)情周期，因此將發(fā)情周期簡化為發(fā)情期和間情期，這樣也便于對基因進(jìn)行定量。

雌激素像其他激素一樣能夠誘導(dǎo)很多生理反應(yīng)，這些作為調(diào)解功能的受體從1960年開始就一直受到關(guān)注。1986年雌激素受體被克隆出來[1]，并在小鼠的很多器官系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了其預(yù)期中的顯型[2]，一時間得出的結(jié)論是僅有這一種雌激素存在。然而1996年，Jan-Ake Gustafsson[3]在重要的學(xué)術(shù)報告會上宣稱他的團(tuán)隊已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了雌激素的第二種形式，從而最先克隆出來的受體被命名為ERα，第二種受體被命名為ERβ，ERβ基因是在應(yīng)用大鼠前列腺cDNA和PCR退火引物探索雄激素受體額外作用的過程中發(fā)現(xiàn)的。一直以來，都有人不斷的研究ERβmRNA在組織中的表達(dá)量，但對比格犬的研究相對較少，因此本實(shí)驗應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)(QRT-PCR)探究ERβmRNA在間情期和發(fā)情期比格犬卵巢、子宮、垂體、下丘腦內(nèi)的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗動物

比格犬12只，發(fā)情期比格犬和間情期比格犬各6只，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗動物中心提供【SCXK(軍)2002-001】。

1.2 儀器和材料

pEGFP-N1-ERβ重組質(zhì)粒，由本實(shí)驗組構(gòu)建，TRIZOL購自Invitrogen公司，DEPC購自Promega公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit)和SYBR? Premix Ex TaqTMII購自TaKaRa公司，Real Time PCR擴(kuò)增儀(BIO-RAD iQTM5)。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 RNA提取及RT-PCR

參照Trizol試劑盒方法[4]提取比格犬下丘腦、垂體、卵巢和子宮中的RNA，依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為：5×PrimeScript Buffer 4 uL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 1 uL，Oligo dT Primer 1 uL，Random 6 mers 1 uL，Total RNA 5uL，RNase Free H2O加至20 uL。反應(yīng)條件為：37℃ 30 min；85℃ 5 s；4℃保存。

1.3.2 合成引物

根據(jù)GenBank 中比格犬的ERβ(XM_861041.2)和β-actin(AF021873)基因序列，利用primer premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計，ERβ基因上下游引物序列分別為：5’-tctcccttagccatccattg-3‘和5’-gcatccctctttgaacttgg-3’, 擴(kuò)增產(chǎn)物長度為179 bp；內(nèi)參基因β-actin上下游引物序列分別為：5’-cctgtcttacccaatgttttcc-3‘和5’-gcagcactttattttcctcacac-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為235 bp，引物送至上海生物工程有限公司合成。

1.3.3 QRT-PCR

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：以pEGFP-N1-ERβ為模板，按照十倍濃度梯度稀釋6個濃度標(biāo)準(zhǔn)，按照預(yù)先篩選好的反應(yīng)條件及反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：SYBR?PremixExTaqTMII 12.5 uL，上游引物1 uL，下游引物1 uL，cDNA模板1 uL，滅菌蒸餾水加至25 uL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃ 30 s；變性95℃ 5 s，退火58℃/63℃(β-actin/ ERβ)20 s，循環(huán)40次；熔解曲線為95℃ 1 min；55℃ 1 min；55℃循環(huán)133次(每隔0.3℃采集一次熒光信號)，到94.6℃,通過熔解曲線對熒光定量PCR產(chǎn)物進(jìn)行特異性分析[5]。所有的樣品都在反應(yīng)孔中做3次重復(fù)。所得數(shù)據(jù)經(jīng)iQ5自帶的軟件進(jìn)行分析整理。

2 結(jié)果

2.1 QRT-PCR結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示ERβ和內(nèi)參基因β-actin相關(guān)系數(shù)R2均大于0.98，說明結(jié)果具有可信度；擴(kuò)增效率分別為98.4%和100%，都在80%～120%之間，而且非常接近1，擴(kuò)增效率理想。內(nèi)參基因β-actin(A)和ERβ基因(B)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示：

此外，R2(β-actin)-R2(ERβ)< 0.1，所以可以通過2- ΔΔCT方法對目的基因進(jìn)行相對定量。擴(kuò)增曲線與熔解曲線表明目的基因及內(nèi)參基因沒有產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增及引物二聚體，可作分析使用。內(nèi)參基因β-actin(A)和ERβ基因(B)的擴(kuò)增曲線如圖2所示：

內(nèi)參基因β-actin(A)和ERβ基因(B)的熔解曲線如圖3所示：

2.2 比格犬卵巢、子宮、垂體、下丘腦中ERβmRNA的相對定量結(jié)果

運(yùn)用2-△△CT法進(jìn)行定量，即△CT目的基因=CT目的基因-CT內(nèi)參基因，△△CT=△CT間情期ERβ基因-△CT發(fā)情期ERβ基因[6]，ERβmRNA表達(dá)差別以2-△△CT表示。間情期的比格犬卵巢、子宮、垂體、下丘腦內(nèi)ERβ基因mRNA的表達(dá)量是發(fā)情期的比格犬卵巢、子宮、垂體、下丘腦內(nèi)ERβ基因mRNA的表達(dá)量的0.35倍、0.17倍、0.44倍、0.43倍，如圖4所示：

圖1 ERβ和β-actin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 β-actin和ERβ基因的擴(kuò)增曲線

注：A：卵巢內(nèi)ERβmRNA的定量結(jié)果；B：子宮內(nèi)ERβmRNA的定量結(jié)果；C：垂體內(nèi)ERβmRNA的定量結(jié)果；D：下丘腦內(nèi)ERβmRNA的定量結(jié)果。

圖5 雌激素調(diào)控發(fā)情的機(jī)制

3 討論

犬類是一次發(fā)情的物種，隨著一段單一發(fā)情階段會有幾個月性活動不活躍。這些繁殖周期根據(jù)下丘腦-垂體-卵巢軸受著內(nèi)分泌調(diào)控?？墒?，調(diào)控雌犬循環(huán)往復(fù)的發(fā)情的確切機(jī)制還不清楚。現(xiàn)如今，另一種ER子類型，ERβ，從大鼠前列腺被克隆出來；ERβ蛋白對雌激素有著高親和性。但是，沒有針對犬類組織中cDNA序列和ERβ的表達(dá)的相關(guān)資料。ERβmRNA主要分布在大鼠粒層細(xì)胞內(nèi)，說明ERβ可能對粒層細(xì)胞增殖起著重要作用?，F(xiàn)如今的研究表明ERβmRNA水平較之間情期早期在間情期末期有著顯著的提高；此外，ERβmRNA水平與血漿中E2水平呈正相關(guān)，這可能暗示犬卵巢內(nèi)的ERβ是與卵泡生長和卵巢反應(yīng)力相聯(lián)系的[7]。雌激素調(diào)控發(fā)情的機(jī)制如圖5所示：

如圖所示，ERβ既在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)起作用，又在細(xì)胞核內(nèi)起作用，發(fā)情期起始雌二醇進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與ERβ結(jié)合形成E2-ERβ復(fù)合體，E2-ERβ復(fù)合體又與效應(yīng)器蛋白相結(jié)合，引起信號級聯(lián)，隨后激活細(xì)胞質(zhì)內(nèi)激酶，之后會引起細(xì)胞核內(nèi)E2-ERβ復(fù)合體與輔表達(dá)蛋白結(jié)合在雌激素反應(yīng)元件上起作用，還會直接作用于轉(zhuǎn)錄因子，再在反應(yīng)元件上起作用，也會使結(jié)合著輔表達(dá)蛋白的E2-ERβ復(fù)合體與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，然后在反應(yīng)元件上起作用，以這種方式復(fù)制的mRNA翻譯成的蛋白質(zhì)會引起細(xì)胞內(nèi)一系列反應(yīng)，反應(yīng)的結(jié)果使得在發(fā)情期ERβ的含量較間情期增多，也就是本實(shí)驗的熒光定量所顯示的結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

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[2] 孔德強(qiáng)，李愛學(xué)，曾林，等．一種比格犬雌二醇β受體剪切異構(gòu)體的克隆和序列分析[J]． 中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2011，21(7) : 44 -47.

[3] Greene GL, Gilna P, Waterfield M,etal. Sequence and expression of human estrogen receptor complementary DNA[J]. Science, 1986, 231: 1150-1154.

[4] Lubahn DB, Moyer JS, Golding TS,etal. Alteration of reproductive function but not prenatal sexual development after insertional disruption of the mouse estrogen receptor gene[J]. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1993, 90: 11162-11166.

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[6] 趙彥斌，孫兆增，曾林，等．黑線倉鼠及其白化突變系 TYR、TYRP1的基因表達(dá)水平比較分析[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2012，22(7)：1-4.

[7] Shingo H, Ryuzo T, Daijiro K,etal. Expression of estrogen receptor α and β genes in the mediobasal[J]. Neuroscience Letters, 2003, 347: 131-135.