小膠質(zhì)細胞在Cuprizone所致髓鞘脫失動物模型中的雙重性作用

梁夢茹，尹琳琳，陳光亮，李 林

(1. 首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院藥物研究室，北京 100053； 2. 安徽中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合臨床學院，合肥 230038)

綜述與專論

小膠質(zhì)細胞在Cuprizone所致髓鞘脫失動物模型中的雙重性作用

梁夢茹1,2，尹琳琳1，陳光亮2，李 林1

(1. 首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院藥物研究室，北京 100053； 2. 安徽中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合臨床學院，合肥 230038)

小膠質(zhì)細胞(microglia)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中固有的免疫監(jiān)視細胞，是CNS的重要組成部分，構(gòu)成CNS的第一道免疫防線。小膠質(zhì)細胞活化是許多CNS疾病的重要病理特征之一，其在多發(fā)性硬化(MS)的發(fā)病過程中扮演重要角色。MS是以炎癥反應(yīng)、髓鞘脫失和軸突損傷為主要特征的CNS疾病，MS患者及實驗動物腦內(nèi)均可見活化的小膠質(zhì)細胞，其作用機制復雜，具有致炎和抗炎雙重作用。一方面小膠質(zhì)細胞可通過促進吞噬、軸突再生、釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子等作用促進髓鞘的再生修復；另一方面小膠質(zhì)細胞還可通過釋放炎性因子、自由基、蛋白酶等對神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞發(fā)揮毒性作用。Cuprizone(雙環(huán)己酮草酰二腙)所致髓鞘脫失動物模型是研究髓鞘再生修復的理想模型，了解小膠質(zhì)細胞的雙重性對于理解MS的發(fā)生發(fā)展，尋找疾病治療靶點具有十分重要的理論和實際意義。在此本文對小膠質(zhì)細胞在cuprizone所致髓鞘脫失動物模型中的雙重性作用做一綜述。

小膠質(zhì)細胞；多發(fā)性硬化；Cuprizone動物模型；雙重性

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)包括腦和脊髓，多發(fā)性硬化(MS)發(fā)病時外周免疫細胞透過通透性增加的血腦屏障進入中樞，在中樞形成許多炎性浸潤病灶，進而導致髓鞘脫失和軸索損傷。髓鞘是包繞在軸突表面的多層膜性結(jié)構(gòu), 由脂類及蛋白質(zhì)組成，既可保護軸索又具有對神經(jīng)沖動傳導的絕緣作用。髓鞘脫失是MS的主要病理特征，髓鞘脫失除了與少突膠質(zhì)細胞的損傷有直接關(guān)系以外, 還與小膠質(zhì)細胞的活化密切相關(guān)[1,2]。Cuprizone (雙環(huán)己酮草酰二腙) 所致髓鞘脫失動物模型能夠誘導大面積髓鞘脫失而非T淋巴細胞介導，是研究MS發(fā)病過程中髓鞘脫失、再生的理想模型。小膠質(zhì)細胞在MS髓鞘脫失、再生的過程中扮演重要角色，小膠質(zhì)細胞活化對髓鞘脫失既有有害的一面，又有有利的一面，本文將對cuprizone所致髓鞘脫失動物模型中小膠質(zhì)細胞的雙重性作用做一綜述。

1 Cuprizone所致髓鞘脫失動物模型

Cuprizone所致髓鞘脫失動物模型是研究MS常用的兩種脫髓鞘動物模型之一。該模型采用摻有0.2%銅離子螯合劑cuprizone的飼料飼喂C57BL/6小鼠，若飼喂6周后改為飼喂正常飼料，將會引發(fā)脫失的髓鞘自發(fā)再生；若連續(xù)飼喂12周，將導致髓鞘不可逆性脫失[3,4]。由于cuprizone可選擇性作用于髓鞘形成細胞—成熟少突膠質(zhì)細胞，cuprizone通過螯合其線粒體復合體IV的銅離子引發(fā)能量代謝障礙，繼而引發(fā)少突膠質(zhì)細胞凋亡不利于髓鞘形成。在胼胝體、海馬、嗅球、喉前聯(lián)合、視交叉、腦干、小腦、紋狀體、皮層、扣帶回等腦區(qū)可見明顯病灶?；瘜W毒素cuprizone所誘導的髓鞘脫失動物模型能夠誘導大面積髓鞘脫失，且非T淋巴細胞介導，是研究MS發(fā)病過程中髓鞘脫失、再生的經(jīng)典模型，同時該模型還具有價格低廉, 容易維持，重現(xiàn)性高等特點[5]。有報道指出，在cuprizone所致髓鞘脫失動物模型的病灶部位有大量小膠質(zhì)細胞聚集，提示小膠質(zhì)細胞很可能在髓鞘脫失及髓鞘再生過程中發(fā)揮重要作用。此外，另一種髓鞘脫失動物模型由溶血卵磷脂(lysolecithin或 lysophosphatidylcholine，LPC)誘導，該模型需經(jīng)脊髓胸段或腰段向中樞白質(zhì)注射LPC誘發(fā)髓鞘脫失，在注射后第2、4、7天呈現(xiàn)出明顯的髓鞘脫失、再生過程，但由于該模型髓鞘脫失、再生持續(xù)時間較短，且造模成功率不穩(wěn)定等特點較少被采用。因此，本文擬在cuprizone所致髓鞘脫失動物模型上探討小膠質(zhì)細胞的作用。

2 小膠質(zhì)細胞

小膠質(zhì)細胞是CNS中體積最小的膠質(zhì)細胞，約占膠質(zhì)細胞數(shù)量的5%，其在神經(jīng)元生理活動中起著支持、營養(yǎng)、保護及修復等重要作用。當CNS受到損傷刺激后，引發(fā)小膠質(zhì)細胞活化，這些活化的小膠質(zhì)細胞能夠?qū)NS功能產(chǎn)生重要影響。在帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)和多發(fā)性硬化(MS)等CNS退行性疾病發(fā)生發(fā)展過程中，原本對神經(jīng)元起支持和營養(yǎng)作用的小膠質(zhì)細胞可逐漸“老化”，處于“老化”狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞與處于正常狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞相比，分泌神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)和吞噬細胞碎片的能力會有所下降，最終導致神經(jīng)元因失去小膠質(zhì)細胞的營養(yǎng)支持而發(fā)生死亡。在所有CNS疾病中幾乎都有小膠質(zhì)細胞活化，其對CNS既有損傷作用又有保護作用。促炎物質(zhì)細菌脂多糖(LPS)和IFN-γ可引起小膠質(zhì)細胞發(fā)生強烈炎癥反應(yīng)，并使其處于激活狀態(tài)。處于激活狀態(tài)中的小膠質(zhì)細胞可分泌大量促炎癥細胞因子，主要有TNF-α和IL-1β，此外還可釋放活性氧簇、超氧化物陰離子和一氧化氮等神經(jīng)毒性物質(zhì)，從而加重神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的損傷[6]；與此同時，激活狀態(tài)中的小膠質(zhì)細胞所分泌的神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)(如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)也會大量減少，失去膠質(zhì)細胞營養(yǎng)支持作用的神經(jīng)元會發(fā)生凋亡，進而影響CNS功能的正常發(fā)揮[7]。

另有研究發(fā)現(xiàn)[8]，神經(jīng)元上的成纖維細胞生長因子-2(FGF-2)表達上調(diào)，可調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞發(fā)揮神經(jīng)保護作用，從而減輕興奮性氨基酸對神經(jīng)元的損傷。將小膠質(zhì)細胞與已發(fā)生凋亡的T細胞共培養(yǎng)，小膠質(zhì)細胞可被激活并被誘導處于吞噬狀態(tài)，此時小膠質(zhì)細胞可釋放較少促炎因子并釋放較多抑炎因子，還可釋放較多神經(jīng)保護因子，如IL-10、神經(jīng)營養(yǎng)因子、TGF-β1等。

綜上所述，通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的不同激活狀態(tài)可促使其分泌神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)和抑炎因子，研究者可通過體外培養(yǎng)激活小膠質(zhì)細胞，將其控制在可分泌較多有益物質(zhì)的狀態(tài)，并收集小膠質(zhì)細胞所分泌的有益物質(zhì)，當CNS發(fā)生損害需要神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)支持時，應(yīng)用上述物質(zhì)可減輕CNS損傷，幫助受損神經(jīng)細胞恢復正常功能[9]。

3 小膠質(zhì)細胞在cuprizone誘導的髓鞘脫失動物模型中有害的一面

給予C57BL/6小鼠含cuprizone的特制飼料2周后，腦內(nèi)出現(xiàn)小膠質(zhì)細胞聚集，至第3周可見顯著脫髓鞘且小膠質(zhì)細胞聚集數(shù)量增加，4-6周后上述病理改變達高峰。而早期超微結(jié)構(gòu)的研究表明，cuprizone不會誘導小膠質(zhì)細胞發(fā)生有絲分裂，因此病灶位置聚集的小膠質(zhì)細胞很可能來自其他腦區(qū)或外周組織[10]。

已有多項研究報道了小膠質(zhì)細胞在cuprizone引起的脫髓鞘動物模型中的有害作用：包括對神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞前體細胞的毒性作用、釋放蛋白酶、炎性細胞因子和自由基、激活CNS炎癥反應(yīng)、致使外周T淋巴細胞浸潤等。體外實驗同樣顯示小膠質(zhì)細胞激活會誘發(fā)神經(jīng)元損傷[11]。將17β-雌二醇給予cuprizone模型小鼠時，不僅髓鞘脫失減輕，而且還伴隨著小膠質(zhì)細胞活化的延遲。提示抑制小膠質(zhì)細胞活化具有髓鞘保護作用[12]。Millet等人的研究表明注射蛋白酶體抑制劑乳胞素，對cuprizone模型小鼠的髓鞘再生過程有較大改善作用，可促進髓鞘再生并伴有小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞數(shù)量減少[13]。此外，有研究報道發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)給予小膠質(zhì)細胞活化抑制劑米諾環(huán)素不僅可以抑制小膠質(zhì)細胞活化與增殖，而且還可以阻止 cuprizone引起的脫髓鞘。由于米諾環(huán)素可顯著抑制小膠質(zhì)細胞的活化，從而抑制炎癥相關(guān)產(chǎn)物的釋放，以致于其在髓鞘脫失過程中的作用降低。研究發(fā)現(xiàn)：給予米諾環(huán)素治療的cuprizone模型小鼠其體內(nèi)小膠質(zhì)細胞激活數(shù)目明顯減少，如CD11b的陽性細胞數(shù)量明顯減少，有助于減輕髓鞘脫失。因此，在cuprizone誘發(fā)的脫髓鞘模型中抑制小膠質(zhì)細胞的活化可以有效緩解髓鞘脫失[14]。

綜上所述，小膠質(zhì)細胞活化在cuprizone引起的脫髓鞘動物模型中具有有害作用，抑制小膠質(zhì)細胞活化可減少髓鞘脫失，修復運動損傷，并促進髓鞘再生。

4 小膠質(zhì)細胞在cuprizone所致髓鞘脫失動物模型中有利的一面

已有許多研究報道了小膠質(zhì)細胞有益的一面，包括促髓鞘、軸突再生，幫助修復髓鞘脫失，釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子、吞噬細胞碎片和促進少突膠質(zhì)細胞前體細胞向成熟少突膠質(zhì)細胞的分化[15]。Olah等[16]通過對從cuprizone模型小鼠胼胝體部位分離到的小膠質(zhì)細胞進行全基因組基因表達研究發(fā)現(xiàn)：小膠質(zhì)細胞具有與吞噬髓鞘碎片相關(guān)的基因表型，同時其還具有通過表達相應(yīng)的細胞因子和趨化因子來招募少突膠質(zhì)細胞前體細胞的基因表型。推測小膠質(zhì)細胞可能參與髓鞘的再生，負責啟動修復過程。Jurevics等研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細胞上述相關(guān)基因表型的出現(xiàn)與病灶修復和髓鞘碎片的吞噬有一定的對應(yīng)關(guān)系，提示小膠質(zhì)細胞在清除代謝產(chǎn)物抑制環(huán)境惡化方面的有益作用。主要組織相容性復合物II (MHC-II) 是一類主要存在于小膠質(zhì)細胞表面的能通過血腦屏障向淋巴細胞提呈抗原的分子。MHC-II類分子缺失的小鼠表現(xiàn)為髓鞘再生延遲和少突膠質(zhì)細胞前體細胞分化為成熟少突膠質(zhì)細胞滯后，提示小膠質(zhì)細胞在促進髓鞘再生方面的有利作用。此外，在缺乏小膠質(zhì)細胞分泌的細胞因子、酶，腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 的小鼠中，髓鞘再生顯著延遲抑或表現(xiàn)為更為嚴重的脫髓鞘，這表明小膠質(zhì)細胞通過分泌上述因子在髓鞘再生過程中發(fā)揮重要作用。Morell等研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細胞還可通過招募少突膠質(zhì)細胞前體細胞(OPCs)并促進其向成熟少突膠質(zhì)細胞分化而發(fā)揮作用。髓鞘特異性標志髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)和髓鞘堿性蛋白(MBP)的mRNA上調(diào)與小膠質(zhì)細胞的聚集具有一定的相關(guān)性可以佐證上述觀點[17]。

綜上所述，小膠質(zhì)細胞通過清除髓鞘碎片、招募并促進OPCs向成熟少突膠質(zhì)細胞分化、釋放有利于髓鞘修復的細胞因子等方式促進髓鞘再生、修復。

5 展望

由此可見，小膠質(zhì)細胞在cuprizone誘導的脫髓鞘動物模型中發(fā)揮雙重作用，它就像一把雙刃劍，對CNS既有損傷作用又有保護作用，在慢性CNS疾病發(fā)生發(fā)展過程中，小膠質(zhì)細胞的活化往往以損傷作用為主；而在急性CNS疾病發(fā)生發(fā)展過程中，小膠質(zhì)細胞的活化則以神經(jīng)保護作用為主。鑒于小膠質(zhì)細胞活化的雙重性，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的活化狀態(tài)，趨利避害，是今后非常有意義的研究方向。

以含不同劑量的cuprizone飼料飼喂 C57BL/6小鼠，隨著cuprizone含量的增加動物出現(xiàn)發(fā)育遲緩的現(xiàn)象顯著增加。若以含0.5%的cuprizone飼料飼喂4周齡的C57BL/6小鼠，致死率達100%；而同樣飼料飼喂8周齡小鼠，致死率降至20%。此外，Hiremath等研究發(fā)現(xiàn)，在一定劑量范圍內(nèi)(0.2～0.5)%，隨著cuprizone喂食劑量的增加和時間的推移，活化小膠質(zhì)細胞的數(shù)目顯著增多[10]。小膠質(zhì)細胞的上述作用提示我們，如何通過調(diào)控小膠質(zhì)細胞的激活狀態(tài)來控制其對CNS功能的影響值得深入研究。然而，精確調(diào)控小膠質(zhì)細胞的活化狀態(tài)并非易事，若處理不慎，可能會使神經(jīng)損害物質(zhì)產(chǎn)生過多，神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生過少。因此，如何精確調(diào)控小膠質(zhì)細胞的激活狀態(tài)，使之更多地發(fā)揮神經(jīng)保護作用是今后的努力方向。

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Dichotomous roles of microglia in cuprizone-induced demyelination in animal models of multiple sclerosis

LIANG Meng-ru1,2, YIN Lin-lin1, CHEN Guang-liang2, LI Lin1

(1. Department of Pharmacology, Xuan Wu Hospital of Capital Medical University, Beijing 100053, China;2. School of Integrated Traditional Chinese & Western Medicine,Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230038, China)

Microglia are the inherent macrophages and immune surveillance cells in the central nervous system (CNS) and compose the first guard of immune defense in CNS. The activation of microglia is one of the pathological features of many CNS diseases and acts as an important role during the multiple sclerosis (MS) process. MS is a CNS disease characterized by neuroinflammatory infiltration, demyelination and axonal damage. Accumulation of activated microglia at the injury site has been observed in brains of MS patients and experimental animals with complicated mechanisms. Microglia have both detrimental and beneficial roles. For instance, microglia have been shown to recruit and reactivate T cells in the CNS and release many detrimental molecules such as proteases, inflammatory cytokines, and free radicals. Conversely, they have also been observed to aid in axonal regeneration and remyelination as well as assist in the clearance of inhibitory myelin debris. In addition, microglia have been shown to release a variety of neurotrophic factors. Cuprizone [oxalic acid bis(cyclohexylidene hydrazide)] is a well-known copper-chelating agent. Cuprizone ingestion in mice induces a highly reproducible demyelination of distinct brain regions. Discussion on the detrimental and beneficial aspects of microglia in cuprizone animal models will serve to better understand the development of MS and find out new therapeutic targets. This review will further our understanding of the dichotomous roles of microglia in cuprizone-induced demyelination in animal models of multiple sclerosis.

Microglia; Multiple sclerosis; Cuprizone, animal model; Dichotomous roles

國家自然科學基金項目(81001656, 81341088)，首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(首發(fā)2011-1001-06)，北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助項目 (2012D005018000010)，北京市科技新星計劃(No. Z12111000250000)。

梁夢茹(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：藥理學，E-mail: 18210866414@163.com。

尹琳琳(1977-)，女，副研究員，博士，研究方向：多發(fā)性硬化的病因病機及新藥研發(fā)。電話：010-83198881，E-mail: yinll913@126.com。

R33；R744.5+1

A

1671-7856(2014) 08-0053-04

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.012

2014-05-08