夏東暉，曹幸毅，王靜宇，袁明，吳士文

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，新鄉(xiāng)市 453003；

2.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)總醫(yī)院，北京市 100039；

3.中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心，航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市 100094)

內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)生的始動(dòng)因素之一，持續(xù)的高血糖可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷甚至凋亡[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是細(xì)胞應(yīng)對(duì)有害刺激時(shí)的一種保護(hù)性調(diào)節(jié)機(jī)制，但持續(xù)或程度較強(qiáng)的ERS可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能障礙，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[2-3]。先前的研究表明，雌激素可通過對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的ERS調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能[4]。GPR30作為新近發(fā)現(xiàn)的雌激素受體，激動(dòng)GPR30可抵抗高糖導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[5]，但這種保護(hù)作用是否通過抑制ERS相關(guān)通路尚未被闡明。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用高濃度葡萄糖干預(yù)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞，觀察ERS與高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系，研究GPR30的特異性受體激動(dòng)劑G1對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ERS及凋亡的影響，探討其保護(hù)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：GPR30受體激動(dòng)劑G1(Sigma 公司, 美國(guó))，Annex V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD Pharmingen公司, 美國(guó))， 抗Bip、IRE1、PERK、Bax、Bcl-2抗體(Cell Signaling Technology公司, 美國(guó))，Trizol(Invitrogen公司, 美國(guó))、PCR引物(北京奧科生物技術(shù)有限公司，中國(guó))，反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(TaKaRa 公司, 日本)。主要儀器：二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(NUAIRE公司, 美國(guó))，倒置顯微鏡(Nikon TS100，日本)，實(shí)時(shí)定量PCR儀(Eppendorf 公司, 美國(guó))，電泳系統(tǒng)(Bio-rad, 美國(guó))，流式細(xì)胞儀(BD FACS Aria II, 美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及處理方法

EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)液中，在5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)80%融合狀態(tài)時(shí)，將細(xì)胞分為3組：正常對(duì)照組(Con，17.51 mmol/L 葡萄糖)、高糖組(HG，33.3 mmol/L)、高糖+G1組(HG+G1,HG+1μmol/L G1)，3組細(xì)胞同時(shí)處理24 h。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡[6]

根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理后，使用0.25%胰酶消化EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞，PBS清洗1次，1500 g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞(1×106細(xì)胞/組)。PBS洗3次，以結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞濃度為1×106/mL，100 μL細(xì)胞懸液，加入annexinV-PE及7-AAD各5 μL，室溫避光15 min，加入400 μL結(jié)合緩沖液，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)。以不加annexinV-PE及7-AAD的一管作為陰性對(duì)照。凋亡及死亡的細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻以致annexin V染色陽(yáng)性；而活細(xì)胞annexin V染色陰性；死亡細(xì)胞則為7-AAD染色陽(yáng)性。即第一象限7-AAD +/annexin V+為死亡細(xì)胞，第二象限7-AAD +/annexin V-為機(jī)械損傷的細(xì)胞，第三象限7-AAD-/annexin V-為活細(xì)胞，第四象限7-AAD -/annexin V+為凋亡細(xì)胞。

1.2.3 RNA提取與實(shí)時(shí)定量PCR

按實(shí)驗(yàn)分組處理EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞并用Trizol法提取各組總RNA，取RNA產(chǎn)物2 μg反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，循環(huán)40次。使用Eppendorff mastercycle熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增及定量分析(表1)。

表1 PCR引物序列

1.2.4 蛋白印跡法[6]檢測(cè)ERS相關(guān)分子蛋白表達(dá)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞(1×106細(xì)胞/組)，使用蛋白裂解液及超聲法提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，取30 μg蛋白加入樣品緩沖液，100℃水煮沸5 min。配制SDS-PAGE凝膠后加入樣品后進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后通過半干電轉(zhuǎn)儀將樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下?lián)u床用含5%脫脂奶粉的TBS-T封閉1 h，以Bip、IRE1、PERK、Bax、Bcl-2、與抗體稀釋液(1∶1000)分別4℃孵育過夜。TBS-T清洗PVDF膜3次，每次10 min，然后與HRP抗兔抗體(1∶1000)室溫孵育1 h后，TBS-T清洗PVDF膜3次，每次10 min，ECL顯色系統(tǒng)X線感光顯影。用掃描儀對(duì)圖片進(jìn)行掃描，以GAPDH蛋白作為內(nèi)參照，進(jìn)行半定量分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 高糖對(duì)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及G1的作用

HG組與Con組比較，細(xì)胞凋亡率明顯升高[(11.2±0.2)% vs(5.4±0.18)%，P<0.01]，差異有顯著性；HG+G1組與HG組比較，細(xì)胞凋亡率明顯降低[(7.8±0.15)% vs (11.2±0.2)%，P<0.05]，差異有顯著性。見圖1。

注：**為HG組與Con組相比差異有顯著性，P<0.01;*為HG+G1組與HG組相比差異有顯著性, P<0.05。

2.2 高糖對(duì)EA.hy926細(xì)胞凋亡相關(guān)分子和ERS相關(guān)蛋白表達(dá)的影響及G1的作用

HG組與Con組比較，Bip、IRE1、PERK及凋亡分子Bax表達(dá)上調(diào)(P<0.05,P<0.01或P<0.001)，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，差異有顯著性；HG+G1組與HG組比較， Bip、IRE1、PERK及凋亡分子Bax表達(dá)下調(diào)(P<0.05或P<0.01)，Bcl-2的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)差異均有顯著性。見圖2。

注：HG組與Con組相比，Bip表達(dá)上調(diào)(P<0.001)；IRE1表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；PERK表達(dá)上調(diào)(P<0.001)；Bax表達(dá)上調(diào)(P<0.01)； Bcl-2表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。結(jié)果差異均有顯著性。HG+G1組與HG組相比，Bip表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；IRE1表達(dá)下調(diào)差異有顯著性(P<0.01)；PERK表達(dá)下調(diào)(P<0.05)； Bax表達(dá)下調(diào)(P<0.01)；Bcl-2表達(dá)上調(diào)(P<0.05)結(jié)果差異均有顯著性。

2.3 高糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞Bip mRNA和CHOP mRNA表達(dá)的影響及G1的作用

HG組較Con組，Bip mRNA、CHOP mRNA 表達(dá)上調(diào)(P<0.001及P<0.01)，差異有顯著性；HG+G1組與HG組比較，Bip mRNA、CHOP mRNA 表達(dá)下調(diào)(P<0.001及P<0.01)，差異有顯著性。見圖3。

注：***為HG組與Con組相比，HG+G1組與HG組相比，BIP mRNA表達(dá)變化差異有顯著性，P<0.001; **為HG組與Con組相比，HG+G1組與HG組相比，CHOP mRNA表達(dá)變化差異有顯著性, P<0.01。

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的早期事件，致動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素均可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷甚至細(xì)胞凋亡[7]。已有研究報(bào)道，高糖作為動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素，可通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[8]，本研究通過流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)持續(xù)的高糖可誘導(dǎo)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡主要有三條通路:死亡受體活化通路、線粒體損傷通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動(dòng)的凋亡通路，前兩者是經(jīng)典凋亡通路，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路是近年來才發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡途徑[9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)折疊加工的主要場(chǎng)所。由于各種原因引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集以及Ca2+平衡紊亂的狀態(tài)稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。Bruno等[10]的研究表明，持續(xù)的高血糖可上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Bip、PERK、IRE1，Bip是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中一種特征性的伴侶蛋白，其誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激起著關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)系統(tǒng)上游的開關(guān)分子，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一種標(biāo)志蛋白[11]。PERK、IRE1在正常情況下都以無活性的狀態(tài)與分子伴侶Bip結(jié)合，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)未折疊蛋白的聚集使Bip與這兩種蛋白分離[12]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，持續(xù)的高糖可上調(diào)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞ERS的標(biāo)志蛋白Bip，上游的感受器蛋白PERK、IRE1。PERK、IRE1都能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CHOP的表達(dá)，在生理狀況下，CHOP的表達(dá)量很少，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，CHOP的含量大量增加并聚集在細(xì)胞核內(nèi)[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HG組較Con組，ERS特異的轉(zhuǎn)錄因子CHOP mRNA表達(dá)增加，具有顯著差異，過量表達(dá)的CHOP通過激活GADD34、ERO1和死亡受體DR5等凋亡反應(yīng)蛋白促進(jìn)細(xì)胞凋亡,也能調(diào)節(jié)其他基因的轉(zhuǎn)錄，比如Bcl-2家族蛋白，Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡領(lǐng)域中倍受關(guān)注，細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的敏感性很大程度上取決于Bcl-2家族促凋亡與抗凋亡蛋白的平衡。CHOP與cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREP)形成二聚體能抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)線粒體對(duì)促凋亡因素的敏感性[14]。本實(shí)驗(yàn)HG組與Con組比較，凋亡蛋白Bax表達(dá)增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低。正常血管內(nèi)皮細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)較低，當(dāng)細(xì)胞受到損傷后Bax蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，對(duì)細(xì)胞凋亡的發(fā)生和調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用[15]，因此，持續(xù)的高糖可促進(jìn)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。

雌激素是類固醇激素家族中重要的激素，參與調(diào)節(jié)許多生理與病理效應(yīng)，具有重要的心血管保護(hù)作用，主要表現(xiàn)在保護(hù)內(nèi)皮、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移、減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和促進(jìn)斑塊消退等方面[16]。Haas等[4]的研究證實(shí)，雌激素可通過對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的ERS調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能，GPR30作為新近發(fā)現(xiàn)的雌激素受體，Li等[5]的研究表明，激動(dòng)GPR30可抵抗高糖導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，但此作用是否通過ERS相關(guān)通路尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以高糖誘導(dǎo)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞ERS為模型，證實(shí)了GPR30特異性受體激動(dòng)劑G1可下調(diào)高糖誘導(dǎo)的ERS相關(guān)蛋白Bip、PERK、IRE1以及凋亡分子Bax，CHOP mRNA，也可上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。因此，GPR30特異性受體激動(dòng)劑G1能對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的ERS及細(xì)胞凋亡，從而拮抗動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。

綜上所述，持續(xù)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用，部分是因?yàn)榧せ盍薊RS相關(guān)凋亡信號(hào)通路，GPR30特異性受體激動(dòng)劑G1可抑制EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而發(fā)揮抗凋亡作用。

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