王逸，盧聰，宋廣青，陳怡西，武宏偉，王瓊,，曲麗娜，李瑩輝，劉新民

(1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193；

2.瀘州醫(yī)學院，瀘州 646000；

3.中國航天員科研訓練中心航天醫(yī)學基礎與應用國家重點實驗室，北京 100094)

應激是人類所處生活環(huán)境中普遍存在的一種外界因素[1]。當今社會，生活節(jié)奏加快、工作壓力增加，生活環(huán)境的改變，使人們暴露于應激事件的頻率和時間都明顯增加[2]。長時間的慢性應激導致的情緒障礙和認知功能損傷，嚴重影響了人們的生活質量[3-5]。本實驗通過行為制動的束縛應激方法造模，選用國內常用的SD、Wistar大鼠為研究對象，采用不同的行為學方法評價動物的學習記憶能力，以期為應激認知損傷動物模型建立、機制研究以及防護藥物的研發(fā)中實驗動物品系的選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器

大鼠行為限制器 (北京鑫海華儀公司，中國)、大鼠水迷宮計算機監(jiān)測分析系統(tǒng)(中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所、中國航天員科研訓練中心、北京三維拓盟數字影像技術有限公司)、物體識別檢測箱(中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所、北京鑫海華儀公司)。

1.1.2 實驗動物

SPF級SD、Wistar雄性大鼠，各12只，190 ～210 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供【SCXK(京)2012-0001】。實驗在中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所進行【SYXK(京) 2008-0019】，照明系統(tǒng)人工控制12 h/12 h明暗循環(huán)(亮燈8：00-20:00，熄燈20:00-次日8:00)，動物分籠飼養(yǎng)，每籠2～4只，適應期間自由飲食飲水。本實驗遵循實驗動物倫理原則。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組

適應性飼養(yǎng)3d后，隨機分為4組，Wistar、SD各2組，每組6只。分別為Wistar 28 d對照組、Wistar 28 d模型組、SD 28 d對照組、SD 28 d模型組。

1.2.2 慢性束縛應激模型的建立

根據文獻報道[6-7]，將造模大鼠置于長約12～16 cm(可調節(jié))，內徑約6 cm的聚酯透明圓柱管內，四肢制動，只允許頭部輕微活動，同時行為限制器頂部有5～6個直徑1 cm左右的通氣小孔供動物呼吸用，每天束縛10 h(22:00-次日8:00)。束縛期間各組禁食禁水，其余時間自由飲食飲水。連續(xù)束縛28 d后，進行行為學檢測。

1.2.3 體重檢測

大鼠于分組前稱重一次。分組后，對4組動物進行體重的監(jiān)測和記錄，稱重均在下午進行，每7 d稱重一次并記錄。

1.2.4 水迷宮空間記憶

水迷宮實驗方法與文獻報道相似[7]。本實驗中，圓形迷宮直徑為159 cm、高50 cm，池中水深25.5 cm左右，內置平臺直徑 9 cm、高24 cm，水溫維持在(24±1)℃。將迷宮置于空間信息相對豐富的實驗環(huán)境中，作為動物學習過程中的空間參照物，整個試驗周期內保持環(huán)境信息固定不變。將迷宮均分為4個象限，將平臺置于其中一個象限中央，作為實驗中動物逃離水環(huán)境的唯一途徑，空間記憶階段保持平臺位置固定不變。選擇其余3個象限作為動物的入水點將動物面向池壁放入水中，每天訓練3次，每次變換入水點位置(使動物可分別從3個象限入水)，且每天所有動物入水點的順序保持一致。每次訓練前適應10 s，使動物獲取并學習空間環(huán)境信息。設置檢測時間為60s后，將動物放入水中，若動物在60 s內找到平臺，算作尋臺成功并記錄其潛伏期，并使其在平臺上停留休息10 s。若動物在60 s內未找到平臺，結束此次訓練并記錄潛伏期為60 s，并引導動物靠近平臺使其在平臺上停留10 s。每只動物訓練的時間間隔為40 min。每天每只動物3次訓練學習的潛伏期平均值，作為評價動物這一天學習能力的指標。

經過5d的訓練學習后，第6天撤去平臺，進行空間探索實驗。將動物從原平臺象限的對角象限面向池壁放入水中，檢測其在60s內在原平臺象限的游程比、時間比，以及穿過原平臺所在位置的次數，作為評價空間記憶能力的指標。

1.2.5 水迷宮工作記憶

空間探索實驗結束次日，開始工作記憶實驗[8]。工作記憶歷時3d，分別將平臺置于其余3個不同象限中，每天變換平臺位置，同一天內平臺位置保持不變。每天訓練3次，依次從其余3個非平臺象限將動物面朝池壁放入水中。訓練前不予適應，其余同空間訓練階段一致。計算3天中，第2次訓練潛伏期的平均值，作為評價動物學習記憶能力的指標。

1.2.6 新物體識別實驗[9-10]

實驗箱為黑色聚酯塑料材質構成的封閉箱，體積為60 cm × 40 cm × 80 cm, 箱體左右兩側各有兩排LED燈條照明，既避免了強光直射對動物行為的干擾，又可以作為計算機對動物行為識別的背景光。頂部采用攝像頭觀察動物的活動情況及探索過程。實驗過程分為3個階段：適應期、熟悉期、測試期。適應期為3d，每天將動物依次放入實驗箱內，熟悉環(huán)境10 min。適應期結束后，次日進行熟悉和測試。熟悉期時，將兩個完全相同的物體放入實驗箱內對稱的位置處，此兩物體距離側箱壁、箱后壁的距離均為10 cm。記錄大鼠5 min內對兩物體的探索總時間。間隔30 min后，進入測試期。測試期內，將其中一個熟悉物體換為另一個大小相近但形狀和顏色不同的新穎物體，記錄大鼠對新穎物體和熟悉物體的探索時間，用辨別指數(discrimination index，DI)來評價動物的學習記憶能力。辨別指數計算公式為DI=(N-F) /(N + F) ×100%，其中N(new)為新穎物體探索時間，F(familiar)為熟悉物體探索時間。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 體重的結果

如表1所示，慢性束縛應激(10 h/d, 28 d)能顯著抑制兩種品系大鼠體重的增加。其中，與對照組相比，Wistar模型大鼠從束縛7d開始體重顯著降低(P<0.001)。SD模型組體重的變化趨勢與Wistar相似，即與對照組相比，從第7天開始束縛應激對SD大鼠體重的增加具有顯著抑制作用。直到束縛第28天，兩種品系大鼠體重依舊顯著低于各自對照組(P<0.001)。

表1 慢性束縛應激對兩種品系大鼠體重的影響(n=6，± s)

2.2 新物體識別實驗結果

如表2所示，在新物體識別實驗中，Wistar大鼠模型組與對照組在熟悉期的探索總時間沒有顯著差異；在檢測期，模型組辨別指數(DI)為負值且低于對照組，但沒有顯著差異。慢性束縛應激對SD大鼠熟悉期的探索行為也沒有產生顯著影響[11]，即模型組與對照組探索總時間沒有顯著差異；而束縛應激使SD模型大鼠檢測期的DI明顯降低，且與對照組比差異性有顯著(P<0.05)。

表2 慢性束縛應激對兩種品系大鼠新物體識實驗的影響(n=6，± s)

2.3 水迷宮空間學習實驗結果

慢性束縛28d后的空間學習能力檢測表明，Wistar模型組學習記憶能力改變不明顯，其潛伏期與對照組比較差異無顯著性(圖1a)。同時由圖1可以看出，SD模型組大鼠的潛伏期與對照組比，出現穩(wěn)定性的增加，在空間學習最后一天(第5天)束縛組的潛伏期與對照組比差異有顯著性(P<0.05)。而兩種品系大鼠水迷宮空間學習階段的游泳速度與各自模型組比差異無顯著性(圖1 b)。

注：a.對潛伏期的影響，b.對游泳速度的影響。*表示與對照組比P<0.05(n=6，± s)。

2.4 水迷宮工作記憶實驗結果

在工作記憶檢測中，計算第2次訓練潛伏期的平均值作為評價工作記憶能力指標[8,12]。由圖2 a可知，每天束縛10 h，束縛28 d后，SD模型組尋臺時間延長，潛伏期增加，與其相應對照組比差異有顯著性(P<0.05)。而束縛應激對Wistar大鼠工作記憶能力影響不顯著。由圖2b 可知，工作記憶階段，束縛應激對Wistar、SD兩種大鼠游泳速度的影響不顯著。

注：a.對潛伏期的影響，b.對游泳速度的影響。*表示與對照組比P<0.05(n=6，± s)。

3 討論

SD和Wistar均屬于遠交系封閉群白色大鼠，是國際和國內臨床前實驗研究、學習記憶損傷機制研究以及相關防護藥物篩選中常用的動物品系。束縛，是將動物置于無法逃脫的應激環(huán)境中，通過行為制動的方式，模擬人類社會中無法避免的擁擠、壓力性空間等應激因素，造成動物心理應激的一種常用的造模方法。慢性束縛，是持續(xù)時間較長的一種造模方式，一般造模時間大于1 d[13]。更好的模擬了現代社會中，人們面臨的壓力持續(xù)時間增加的情況。本實驗首次通過兩種不同的認知行為學評價方法考察束縛應激對這兩品系大鼠學習記憶能力的影響。

水迷宮定位航行實驗是考察動物空間學習記憶能力的一種常用方法[8]。本實驗的結果表明慢性束縛應激(10 h, 28 d)對SD大鼠空間學習記憶的損傷更明顯(見圖1)。這與兩品系大鼠中樞神經系統(tǒng)中海馬區(qū)神經元的數量及功能有關。應激特征性地對HPA軸(下丘腦-垂體-腎上腺軸)的激活，最終會導致糖皮質激素(大鼠主要為皮質酮，人主要為皮質醇)分泌的增加[14]。糖皮質激素在中樞系統(tǒng)中，主要通過海馬神經元中豐富的糖皮質激素受體，影響與海馬密切相關的空間學習記憶[15-16]。而SD大鼠較Wistar大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)含量更為豐富的錐體神經元細胞[17]，可能是應激引起SD大鼠神經元損傷強度和波及范圍較廣，進而導致空間學習記憶能力出現更為明顯的損傷的重要原因。

新物體識別實驗是評價動物識別記憶的簡單、靈敏的方法[10]。本研究中，兩品系模型大鼠在熟悉期表現出與各自對照組相同的探索能力，但是檢測期的辨別指數與對照組比出現差異。這排除了探索行為的改變對認知檢測結果的干擾，同時表明束縛應激對大鼠的識別記憶能力產生損傷，且對SD大鼠的損傷更明顯(見表2)。

水迷宮工作記憶實驗結果也表明，慢性束縛應激對SD大鼠的非空間學習記憶能力的損傷較Wistar大鼠更明顯(見圖2)。

結果表明，慢性束縛應激引起的外周作用在兩品系大鼠中表現一致[18]。兩種檢測方法中，水迷宮對動物的體力要求較高，其具體體現在游泳速度上。而圖1，2表明束縛應激在對速度的影響不顯著的情況下，可引起空間學習能力、工作記憶的損傷。進而表明體重下降只是應激引起的外周作用的一種表現，與學習記憶能力并沒有一定的相關性。

在慢性束縛應激模型建立過程中，根據所用束縛器的形狀、規(guī)格不同，主要有以下的束縛方式[19]：(1)將動物置于圓形或錐形透明樹脂束縛器內；(2)將動物固定于平板或襯墊上；(3)將動物裹在毛巾中；(4)將動物置于金屬鐵絲束縛器中，等。本研究所用方式在不影響動物生理代謝的情況下，盡量避免了對動物的物理性傷害，產生單純由壓力性空間所導致的心理應激模型。符合動物倫理的要求，同時滿足了心理應激的造模條件。

同時，本實驗通過2種行為學方法(物體認知、水迷宮)中的3種模式(新物體識別模式、空間記憶模式、工作記憶模式)，分別考察了所采用的慢性束縛應激(10 h，28 d)造模方式對Wistar、SD兩品系大鼠空間、非空間學習記憶能力的影響。3種模式的實驗結果均表明本研究采用的束縛應激方式可對大鼠認知能力產生損傷，且SD大鼠的損傷更明顯。因此，本方法可作為束縛應激造模的一種方法，用以研究心理應激對學習記憶能力的影響。且本實驗研究結果表明，在束縛應激所致認知損傷機制研究以及防護藥物的篩選中，選用SD大鼠作為實驗動物更為適宜。

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