樊惠，馮慧利，黨惠子，陳曉培，任映，楊金鐸，王蓬文

(國(guó)家中醫(yī)藥管理局三級(jí)實(shí)驗(yàn)室北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室；北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部和北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是癡呆最常見的類型，也是導(dǎo)致老年人群發(fā)病和死亡的主要原因之一。2005年全世界AD發(fā)病人數(shù)已高達(dá)2430萬(wàn)，并且還在以每年460萬(wàn)的速度增加，預(yù)計(jì)到2040年將會(huì)達(dá)到8110萬(wàn)，且絕大多數(shù)發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家(約占70%)[1]。AD發(fā)病最大的危險(xiǎn)因素是年齡[2]，隨著各國(guó)人口老齡化，AD引發(fā)的醫(yī)療和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)在未來(lái)幾十年會(huì)逐年攀升，目前對(duì)AD的治療藥物多為對(duì)癥治療，急需開發(fā)針對(duì)病因、早期阻斷AD發(fā)展的更有效的治療藥物(disease-modifying drugs)。研究表明鳥嘌呤核苷具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)，增加合成和釋放神經(jīng)/多效蛋白如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、TGF-β和基本成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子[3,4]。因此，鳥苷可能在神經(jīng)炎性/神經(jīng)變性疾病，特別是AD的治療中是一種極具療效的潛在藥物。

本研究采用動(dòng)物模型為APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠，該模型是國(guó)際公認(rèn)的研究AD的基因修飾模型，該模型的特點(diǎn)是短期內(nèi)產(chǎn)生大量的Aβ，發(fā)生擬AD的病理改變，研究表明3.5月齡的APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)空間記憶障礙，伴有明顯降低乙酰膽堿、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶[5]。以膽堿酯酶抑制劑鹽酸多奈哌齊為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)選用以往課題證明對(duì)神經(jīng)有保護(hù)作用的姜黃素為中藥治療組[6]，通過水迷宮檢測(cè)行為學(xué)改變，觀察鳥嘌呤核苷和姜黃素對(duì)小鼠行為學(xué)影響，初步探討鳥嘌呤核苷、姜黃素對(duì)AD早期學(xué)習(xí)記憶的影響，為探尋防治AD的潛在靶標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

姜黃素[6]；鹽酸多奈哌齊為衛(wèi)材藥業(yè)有限公司制造，中國(guó)，批號(hào)H20050978；鳥嘌呤核苷為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，批號(hào)G6264；羧甲基纖維素鈉(carboxymethyl cellulose，CMC)為北京精求化工有限責(zé)任公司，批號(hào)為3405005。MD-021小鼠Morris水迷宮，上海移碼數(shù)字有限公司(中國(guó))。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠60只和C57/BL6J小鼠12只，均為3月齡雄性小鼠，體重25～30 g。均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所[SCXK(京)2009-0004]，于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院屏障環(huán)境動(dòng)物室[SYXK(京)2009-0028]飼養(yǎng)。所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)中自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)操作程序均通過東直門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)和使用管理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)為2013-09)。

1.2 方法

1.2.1 分組和給藥

隨機(jī)將3月齡APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠分為模型組、鹽酸多奈哌齊組、鳥嘌呤核苷組、姜黃素組、姜黃素鳥苷組，每組12只，每天給藥1次，連續(xù)給藥1個(gè)月。鹽酸多奈哌齊組，鹽酸多奈哌齊0.92 mg/(kg·d)灌胃和等體積的生理鹽水腹腔注射；鳥嘌呤核苷組，鳥嘌呤核苷20 mg/(kg·d)腹腔注射和等體積的0.5% CMC灌胃；姜黃素組，姜黃素200 mg/(kg·d)灌胃和等體積的生理鹽水腹腔注射；姜黃素鳥苷組，鳥嘌呤核苷20 mg/(kg·d)腹腔注射和姜黃素200 mg/(kg·d)灌胃；選用同月齡C57/BL6J小鼠為正常對(duì)照組，該組和模型組給予等體積0.5%灌胃和等體積生理鹽水腹腔注射。

1.2.2 Morris 水迷宮測(cè)試

Morris水迷宮檢測(cè)小鼠的定位航行和空間搜索等學(xué)習(xí)記憶和記憶保持能力[6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 鳥嘌呤核苷、姜黃素對(duì)4月齡AD小鼠定位航行能力的影響

隨訓(xùn)練次數(shù)增加，各組小鼠的逃避潛伏期中間有波動(dòng)，但整體呈下降趨勢(shì)。第4天，與模型組相比，正常對(duì)照組小鼠逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01)；治療組與模型組小鼠相比逃避潛伏期相比減短(P<0.05)。第5天，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠逃避潛伏期明顯減短(P<0.01)，模型組小鼠逃避潛伏期與姜黃素組、姜黃素鳥苷組相比延長(zhǎng)(P<0.05)(表1)。

表1 鳥嘌呤核苷、姜黃素對(duì)4月齡AD小鼠逃避潛伏期的影響 ±s，n=12)

2.2 鳥嘌呤核苷、姜黃素對(duì)4月齡AD小鼠空間探索能力的影響

隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng),各組小鼠的游泳距離而有所減少，中間略有的波動(dòng)。第3天，模型組游泳距離比正常組明顯延長(zhǎng)(P<0.01)，治療各組游泳距離比模型組有所減少(P<0.05)，而姜黃素鳥苷組游泳距離則明顯減少(P<0.01)。第4、5天，模型組游泳距離比正常組均明顯延長(zhǎng)(P<0.01)，姜黃素組、姜黃素鳥苷與模型組相比，游泳距離均減少(P<0.05)(表2)。

表2 鳥嘌呤核苷、姜黃素對(duì)4月齡AD小鼠空間探索能力的影響±s，n=12)

2.3 鳥嘌呤核苷、姜黃素對(duì)AD雙轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)記憶和記憶保持能力的影響

撤臺(tái)實(shí)驗(yàn)小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)：與正常對(duì)照組比，模型組小鼠120 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.01)；與模型組比，鳥苷組、鹽酸多奈哌齊組、姜黃素鳥苷組穿越平臺(tái)次數(shù)穿越次數(shù)有所增加(P<0.05)，姜黃素組則顯著增加(P<0.01)。撤臺(tái)后小鼠的目標(biāo)象限停留時(shí)間結(jié)果與穿越平臺(tái)次數(shù)基本一致(表3)。

表3 鳥嘌呤核苷、姜黃素對(duì)APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)的影響 ±s，n=12)

3 討論

鳥苷(guanosine)是核苷的一種，是由鳥嘌呤與核糖(呋喃核糖)環(huán)組成。鳥苷經(jīng)過磷酸化之后可變成鳥苷單磷酸(GMP)、環(huán)鳥苷單磷酸(cGMP)、鳥苷雙磷酸(GDP)或鳥苷三磷酸(GTP)。若鳥苷與脫氧核糖相連，則會(huì)產(chǎn)生脫氧鳥苷。鳥苷的用途十分廣泛，磷酸化產(chǎn)物可以作為激素的第2信使，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮激素調(diào)節(jié)生理機(jī)能和物質(zhì)代謝作用，能改變細(xì)胞膜的功能，對(duì)糖、脂肪代謝、核酸、蛋白質(zhì)的合成調(diào)節(jié)等起著重要的作用。鳥嘌呤核苷是一種分布在大腦細(xì)胞外的嘌呤核苷，在生理和病理?xiàng)l件其濃度甚至高于其有較多認(rèn)識(shí)的同類嘌呤核苷—腺苷。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)果顯示，對(duì)AD雙轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)的學(xué)習(xí)記憶障礙，鳥嘌呤核苷有改善作用，Aβ除了是AD的致病因素，正常情況下它們?cè)诖竽X中也會(huì)少量的產(chǎn)生，一些證據(jù)表明它們可以調(diào)節(jié)突觸可塑性和記憶功能[7]。有研究證實(shí)在用Aβ42處理的人成神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞中，鳥苷能明顯降低Aβ42引起的早期氧化反應(yīng)物的形成，也能夠抑制細(xì)胞內(nèi)外的Aβ42的釋放和抑制β分泌酶的活性[8]，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)鳥嘌呤核苷保護(hù)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，抵抗星形孢菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和對(duì)抗β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡，在這兩種情況下，鳥嘌呤核苷的抗凋亡作用是由磷脂酰肌醇3 -激酶(PI3K)/ Akt蛋白和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)細(xì)胞的生存通路介導(dǎo)的[9]。

姜黃素是從中藥姜黃、郁金等根莖中提取的多酚色素。研究表明姜黃素可以有效地預(yù)防和改善認(rèn)知功能障礙，與它抗氧化、 抗炎并調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)等作用有關(guān)[10]，作為一種天然的抗氧化劑，其含有的酚性羥基可以直接捕獲或清除Aβ產(chǎn)生的自由基，還可通過超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物等抗氧化酶介導(dǎo)發(fā)揮抗氧化作用。體外研究表明，姜黃素抑制腦小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，抑制Aβ寡聚體的形成和纏結(jié)，體內(nèi)研究表明，姜黃素可以逆轉(zhuǎn)Aβ造成神經(jīng)炎癥反應(yīng)[11]。我們以往的研究表明，姜黃素治療3個(gè)月或6個(gè)月可以通過改善突觸結(jié)構(gòu)、增加Aβ降解酶NEP和IDE的表達(dá)，改善胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(PI-3-K/Akt通路)和突觸后膜相關(guān)蛋白進(jìn)而改善APPswe /PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[12-14]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討姜黃素灌胃治療1個(gè)月即可早期改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶和記憶保持能力。

如上所述鳥嘌呤核苷和姜黃素同樣可以通過降低Aβ和作用于PI3K/Akt通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)觀察二者疊加是否會(huì)出現(xiàn)協(xié)同作用，結(jié)果短期協(xié)同作用并不明顯，原因不明，考慮是否與β分泌酶量和通路受體結(jié)合量等因素有關(guān)。實(shí)驗(yàn)選用臨床治療AD廣泛應(yīng)用的可逆的高度選擇性乙酰膽堿酯酶抑制劑鹽酸多奈哌齊為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果顯示，單獨(dú)應(yīng)用鳥嘌呤核苷、姜黃素以及兩者聯(lián)合均可改善AD小鼠的認(rèn)知，尤其是姜黃素單獨(dú)使用作用明顯，與鹽酸多奈哌齊相比無(wú)顯著差異，由此得出鳥嘌呤核苷和姜黃素雖改善AD小鼠空間探索和記憶保持能力，從而改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] Cleusa P Ferri, Martin Prince, Carol Brayne, et al.Global prevalence of dementia: a Delphi consensus study[J].Lancet,2005,366 (9503): 2112-2117.

[2] Appleby BS, Cummings JL.Discovering New Treatments for Alzheimer’s disease by repurposing approved medications[J].Curr Top Med Chem,2013,13(18):2306-2327.

[3] Frizzo ME, Lara DR, Dahm KC, et al.Activation of glutamate uptake by guanosine in primary astrocyte cultures[J].Neuroreport,2001,12(4):879-881.

[4] D′Alimonte I, Flati V, D′Auro M, et al.Guanosine inhibits CD40 receptor expression and function induced by cytokines and beta amyloid in mouse microglia cells[J].J Immunol,2007,178(2):720-731.

[5] Zhang W, Bai M, Xi Y, et al.Early memory deficits precede plaque deposition in APPswe/PS1dE9 mice: involvement of oxidative stress and cholinergic dysfunction[J].Free Radic Biol Med,2012, 52(8):1443-1452.

[6] 樊惠,魏鵬,陳曉培,等.姜黃素對(duì)9月齡APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)的影響[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2013,23(6):33-37.

[7] Townsend M, Shankar GM, Mehta T, et al.Effects of secreted oligomers of amyloid beta2protein on hippocampal synaptic plasticity :a potent role for trimers[J].J Physiol ,2006 ,572 (pt2) :477-492.

[8] Tarozzi A, Merlicco A, Morroni F,et al.Guanosine protects human neuroblastoma cells from oxidative stress and toxicity induced by Amyloid-beta peptide oligomers[J].J Biol Regul Homeost Agents,2010 ,24(3):297-306.

[9] Pettifer KM, Kleywegt S, Bau CJ ,et al.Guanosine protects SH-SY5Y neuroblastoma cells against β-amyloid-induced apoptosis[J].Neuroreport,2004, 15 (5):833-836.

[10] Ishrat T, Hoda MN, Khan MB, et al.Amelioration of cognitive deficits and neurodegeneration by curcumin in rat model of sporadic dementia of Alzheimer’s type (SDAT)[J].Eur Neuropsychopharmacol,2009,19(9):636-647.

[11] Davinelli S, Sapere N, Zella D, et al.Pleiotropic protective effects of phytochemicals in Alzheimer’s disease[Published online].Oxid Med Cell Longev, 2012, 2012: 386527.

[12] 樊惠,魏鵬,陳曉培,等.姜黃素對(duì)9月齡AD模型雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬超微結(jié)構(gòu)的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2013,36(9):608-611.

[13] 黨惠子,李瑞晟,王虹,等.姜黃素對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬AKT及p-AKT表達(dá)的影響[J].中國(guó)中藥雜志, 2013,38(19):64-68.

[14] 王蓬文,李瑞晟,王虹,等.姜黃素對(duì)APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠Aβ生成和降解的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào).2010,18(5):367-371.