包夢醒，吳 新

（1.蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所 ，江蘇 蘇州215000；2.蘇州出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 蘇州215000；3.蘇州世標(biāo)檢測技術(shù)有限公司，江蘇 蘇州215000）

從細(xì)菌基因工程到細(xì)胞基因工程，再發(fā)展到轉(zhuǎn)基因動物，科學(xué)家一直在努力探索生產(chǎn)藥用蛋白的更好方式。細(xì)菌結(jié)構(gòu)簡單，操作簡單，但缺乏翻譯后加工機(jī)制，表達(dá)的重組蛋白需經(jīng)修飾才有活性，增加了生產(chǎn)的成本和工藝復(fù)雜性；哺乳動物細(xì)胞具有轉(zhuǎn)錄后加工修飾能力，但培養(yǎng)條件苛刻，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。1980年，第一只轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)，讓科學(xué)家們將生產(chǎn)藥用蛋白的希望轉(zhuǎn)向轉(zhuǎn)基因動物。

在轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)最理想表達(dá)蛋白的場所就是乳腺，自從1987年Gorden首次成功地從轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁中獲得了人類組織型溶酶原激活劑tPA以來［1］，乳腺生物反應(yīng)器就成為各國科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。美國的GTC公司、英國的PPL公司以及荷蘭的Pharming等公司投入大量資金研發(fā)乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白，目前已經(jīng)生產(chǎn)出100多種藥用蛋白，很多都已經(jīng)進(jìn)入臨床階段。2006年和2009年，GTC公司用山羊乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的重組人抗凝血酶Ⅲ（ATryn）分別被歐洲藥監(jiān)局EMA和美國FDA批準(zhǔn)，成為第一個被批準(zhǔn)上市的轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器生產(chǎn)的藥物；2010年，荷蘭Pharming公司用轉(zhuǎn)基因兔生產(chǎn)的單克隆抗體藥物Ruconest，成為第二個獲得歐洲藥品管理局批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物。本文主要從乳腺生物反應(yīng)器的概念、原理、特點(diǎn)、主要的轉(zhuǎn)基因技術(shù)及問題等進(jìn)行綜述，以期為乳腺生物反應(yīng)器的相關(guān)研究提供參考。

1 乳腺生物反應(yīng)器的概念及原理

乳腺生物反應(yīng)器（mammary gland bioreactor）亦稱為轉(zhuǎn)基因動物乳腺個體表達(dá)系統(tǒng)，是指利用哺乳動物乳腺特異性啟動子調(diào)控元件指導(dǎo)目的基因在乳腺中特異性表達(dá)，以期從轉(zhuǎn)基因動物乳汁中獲取重組蛋白的一種生物反應(yīng)器［2］。乳腺生物反應(yīng)器的原理主要是利用雌性動物產(chǎn)仔后乳腺分泌乳汁的特點(diǎn)，利用乳蛋白基因的乳腺特異性調(diào)控成分驅(qū)動外源基因在動物乳腺中高效表達(dá)，從而在乳汁中源源不斷獲得外源性蛋白。

2 乳腺生物反應(yīng)器的特點(diǎn)

轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器主要包括乳腺生物反應(yīng)器、血液生物反應(yīng)器、膀胱生物反應(yīng)器、家禽生物反應(yīng)器等，與其它轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器相比，乳腺生物反應(yīng)器具有很多特點(diǎn)：

①乳汁是動物分泌的天然產(chǎn)物，經(jīng)常收集不會對動物造成健康損害；②產(chǎn)量高，以一頭奶牛產(chǎn)奶量10 000kg／年，蛋白含量3%，轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)的蛋白占總蛋白的1%對于藥用蛋白來說產(chǎn)量是非?？捎^的；③成本低，轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)奶是農(nóng)業(yè)化生產(chǎn)過程，生產(chǎn)、管理成本都較現(xiàn)代生化制藥低；④乳腺分泌藥物蛋白，能對蛋白進(jìn)行糖基化、脂化、磷酸化、羧化等修飾加工，產(chǎn)物更接近天然產(chǎn)物；⑤乳腺生物反應(yīng)器一般生產(chǎn)蛋白就在乳腺系統(tǒng)，對其它動物身體系統(tǒng)幾乎不產(chǎn)生負(fù)面影響；⑥純化簡單，乳汁中蛋白種類較少，目的產(chǎn)物易純化。

3 乳腺生物反應(yīng)器主要轉(zhuǎn)基因技術(shù)

乳腺生物反應(yīng)器的構(gòu)建過程主要包括以下幾個步驟：首先分離和改造目標(biāo)基因，將目的基因與乳蛋白基因的啟動子結(jié)合，構(gòu)建表達(dá)載體，將融合的基因注射到受精卵或者多潛能干細(xì)胞（ES細(xì)胞［3］、iPS細(xì)胞［4－5］等），再植入受體動物，使其懷孕產(chǎn)下能表達(dá)藥物蛋白的轉(zhuǎn)基因幼仔，最后使轉(zhuǎn)基因幼仔懷孕繁殖下一代，擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因種群。下面對涉及的關(guān)鍵步驟和技術(shù)進(jìn)行簡單介紹。

3.1 構(gòu)建表達(dá)載體

3.1.1 目的基因 從1987年從小鼠中獲得人類組織型溶酶原激活劑tPA以來，一百多種目的基因在乳腺生物反應(yīng)器中獲得表達(dá)，AT－III、AAT、蛋白C、乳鐵蛋白、乳糖酶、干擾素、胰島素、血清白蛋白等產(chǎn)物都已經(jīng)成功獲得。理論上將，大部分蛋白質(zhì)都可以通過乳腺表達(dá)，但是因?yàn)槿橄偕锓磻?yīng)器的特點(diǎn)，更適合生產(chǎn)正常情況下濃度低、翻譯后修飾復(fù)雜、其他表達(dá)體系難以表達(dá)或者表達(dá)量低、臨床用量較大的藥用蛋白。

3.1.2 調(diào)控序列 外源基因如果要在乳腺生物反應(yīng)器中高效表達(dá)需要同時滿足兩個條件：一、目標(biāo)產(chǎn)物能高效、特異地獲得表達(dá)并分泌到乳汁中，乳腺的特異表達(dá)序列成為研究的重點(diǎn)；二、構(gòu)建的表達(dá)載體要處于開發(fā)和活躍的狀態(tài)。傳統(tǒng)表達(dá)載體一般選用某種乳蛋白基因的調(diào)控序列作為調(diào)控序列的核心元件，主要有β－酪蛋白基因 （BLG）基因、αS1－酪蛋白基因、β－乳球蛋白、乳清酸性蛋白基因（WAP）以及乳清白蛋白基因。反芻動物一般采用同一物種的啟動子，并以BLG最多；家兔、豬和鼠類則采用多采用嚙齒類WAP；不同乳蛋白調(diào)控元件也可以混用。

表達(dá)載體的構(gòu)建一般有幾種類型：一、基于普通質(zhì)粒的表達(dá)載體，主要包括啟動子、增強(qiáng)子、激素應(yīng)答區(qū)、位點(diǎn)控制區(qū)、核基質(zhì)黏附區(qū)、5＇和3＇非翻譯區(qū)、PolyA位點(diǎn)等調(diào)控元件，但是人工雕琢的痕跡明顯，容量較小，是早期研究較多的載體類型；二、基于酵母人工染色體的表達(dá)載體，酵母人工染色體（YAC）是新的大容量載體，主要包括著絲粒、端粒、復(fù)制原點(diǎn)。YAC的構(gòu)建使在整個獨(dú)立轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)插入外源基因成為可能，保持了乳蛋白調(diào)控的天然狀態(tài)。三、基于基因敲入的表達(dá)載體，有時外源基因插入著絲粒這一類異染色質(zhì)區(qū)時，往往造成表達(dá)載體處于壓縮狀態(tài)，轉(zhuǎn)錄因子根本無法接近。即使調(diào)控序列有效，外源基因也無法表達(dá)。這種現(xiàn)象叫作位點(diǎn)效應(yīng)，即轉(zhuǎn)基因動物基因組中表達(dá)載體插入位點(diǎn)的鄰近序列對外源基因表達(dá)的影響［6］。基因基因敲入的表達(dá)載體主要指基因打靶，將帶啟動子的外源基因敲入一些開放的、活躍轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)，對克服位點(diǎn)效應(yīng)有重要作用。

3.2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)

目前制備乳腺生物反應(yīng)器的主要技術(shù)有原核顯微注射技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄病毒感染技術(shù)、精子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)技術(shù)等，各有優(yōu)勢也各有其局限性。

3.2.1 原核顯微注射技術(shù) 原核顯微注射技術(shù)是1980年由Gordon［1］等創(chuàng)建的經(jīng)典技術(shù)，主要是將目的基因直接注射到受精卵原核內(nèi)部。優(yōu)點(diǎn)：①外源基因分子大小基本不受限制；②操作相對簡單，轉(zhuǎn)基因個體整合率高，在雙原核注射時整合目的基因的小鼠能達(dá)到50%［7］；③研究較早，技術(shù)較成熟，已經(jīng)在小鼠、家兔、豬、山羊、綿羊等多種動物上獲得成功。缺點(diǎn)：①設(shè)備昂貴，成本高；②整合位點(diǎn)隨機(jī)，效率低、可能破壞重要的內(nèi)源基因，易導(dǎo)致所需基因失活或胚胎死亡；③不能再早期確定轉(zhuǎn)基因動物的性別，增加工作量。

3.2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染技術(shù) 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染技術(shù)主要是逆轉(zhuǎn)錄病毒在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，逆轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA再整合到宿主染色體上，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因操作。Breme［8］和Schatten［9］等利用該技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)基因奶牛和轉(zhuǎn)基因猴。優(yōu)點(diǎn)：①目的基因整合有序且較穩(wěn)定；②拷貝數(shù)和插入位點(diǎn)相對固定，在牛等某些特定動物上效率較高；缺點(diǎn)：①對插入的目的基因大小有限制；②插入有一定隨機(jī)性，容易產(chǎn)生嵌合體。

3.2.3 精子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù) 主要包括精子載體技術(shù)和胞內(nèi)精子注射技術(shù)。精子載體技術(shù)還未得到大多數(shù)科學(xué)家的認(rèn)可，這個技術(shù)的原理主要是精子質(zhì)膜能結(jié)合DNA，反對者主要認(rèn)為如果精子吸收DNA如此簡單的話，物種不可能這么穩(wěn)定地代代遺傳。CHEN等利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的精子載體技術(shù)，獲到了表達(dá)GFP基因的家兔［10］。胞內(nèi)精子注射技術(shù)是由Perry等人首次提出，首先用去污劑、凍融或凍干等方法處理精子，和目的基因共孵育后注射到MⅡ期卵母細(xì)胞質(zhì)。操作及原理與顯微注射類似，但純合后代較多，目前只在小鼠中獲得了成功。

3.2.4 胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)技術(shù) 胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cells，ES細(xì)胞）是一種從早期胚胎的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（Inner Cell Mass，ICM）細(xì)胞或胎兒原始生殖細(xì)胞（primordial germ cells，PGCs）經(jīng)分離、體外抑制分化培養(yǎng)得到的具有發(fā)育全能性 （或多能性 ）的細(xì)胞［11］，具有不斷自我更新和高度分化潛能的特點(diǎn)。胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)技術(shù)主要是用外源基因轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞，通過篩選、富集再轉(zhuǎn)移進(jìn)囊胚，并轉(zhuǎn)移到個體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因動物。該技術(shù)的優(yōu)勢主要有：①能提前確定性別并進(jìn)行篩選；②能對基因進(jìn)行加入、剔除或者替換等修飾。但是，目前該技術(shù)只在小鼠和大鼠上獲得成功，牛、羊、豬等大動物的乳腺生物反應(yīng)器還未成功。近年來，干細(xì)胞研究領(lǐng)域不斷獲得新的研究成果，1999年發(fā)現(xiàn)了成體干細(xì)胞具有跨系跨胚層分化的“可塑性 ”；2006年，Takahashi和Yamanaka首次利用小鼠皮膚成纖維細(xì)胞成功獲得類似胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcells，ES細(xì)胞）的多能干細(xì)胞［12］，命名為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 （induced pluripotent stem cells，iPS細(xì)胞 ），具有和ES細(xì)胞幾乎一樣的生物學(xué)特性，為牛、羊、豬等大動物的乳腺生物反應(yīng)器的建立提供新思路。

3.2.5 基因打靶技術(shù) 基因打靶技術(shù)主要是利用外源基因與細(xì)胞基因組同源序列發(fā)生同源重組，對細(xì)胞基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾的技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對外源基因的定點(diǎn)整合?；虼虬蟹ㄖ苽淙橄偕锓磻?yīng)器相比早期的顯微注射法，具有定位準(zhǔn)確和能對內(nèi)源基因修飾等特點(diǎn)。

根據(jù)打靶對象細(xì)胞的不同，可分為胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)和體細(xì)胞介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)。利用小鼠ES細(xì)胞的基因打靶技術(shù)現(xiàn)已成為一種常規(guī)技術(shù)，但目前利用ES細(xì)胞基因打靶技術(shù)對大動物的乳腺生物反應(yīng)器的研制還未成功。2009年，青島森淼生物技術(shù)有限公司與青島森淼生物技術(shù)研究所研發(fā)的我國首個利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的抗凝血酶Ⅲ蛋白純品研究成果通過國家級項(xiàng)目評估。該研究主要是采用基因打靶技術(shù)制備乳腺生物反應(yīng)器，將藥物蛋白基因定點(diǎn)整合到山羊內(nèi)源的乳腺蛋白基因中，在國內(nèi)首次獲得藥用蛋白轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆奶山羊，構(gòu)建成功3種重組藥用蛋白乳腺生物反應(yīng)器，使我國成為繼美國GTC公司之后，世界上第二家擁有該技術(shù)的企業(yè)。

3.2.6 體細(xì)胞核移植技術(shù) 體細(xì)胞核移植技術(shù)的核心技術(shù)是克隆技術(shù)，主要是將目的基因轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)細(xì)胞中，篩選出整合有目的基因或獲得相應(yīng)的遺傳修飾的細(xì)胞后，克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，然后將細(xì)胞核移入去核的卵細(xì)胞中，獲得的重構(gòu)胚移入代孕母體，從而獲得轉(zhuǎn)基因個體。1997年，Schnieke等首次通過細(xì)胞核移植技術(shù)獲得表達(dá)凝血因子的綿羊乳腺生物反應(yīng)器［13］。與經(jīng)典顯微注射法相比，具有效率高、生產(chǎn)周期短，預(yù)先決定性別，易于與基因打靶技術(shù)結(jié)合等優(yōu)勢?；虼虬屑夹g(shù)的定點(diǎn)整合技術(shù)理論上能夠克服顯微注射技術(shù)的位置效應(yīng)的缺點(diǎn)，這兩種技術(shù)相結(jié)合具有基因定點(diǎn)整合、高效特異性表達(dá)等優(yōu)勢，是未來乳腺生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展方向。2000年，McCreath等通過基因打靶技術(shù)和核移植技術(shù)相結(jié)合，成功培育出乳汁中hAAT表達(dá)量0.65mg／mL的轉(zhuǎn)基因綿羊［14］。

3.3 純化技術(shù)

分離純化是乳腺生物反應(yīng)器研制成功后，投入規(guī)?；a(chǎn)的下游關(guān)鍵步驟。因?yàn)槟繕?biāo)種類的多樣性，所以分離純化對于特定的產(chǎn)物可能采取不同的分離步驟和方法。白倩等以國產(chǎn)高交聯(lián)度的快流速瓊脂糖為基質(zhì)，合成了不同配基密度的SP（Sulfopropyl，磺酸基）離子交換介質(zhì)，建立了乳腺生物反應(yīng)器表達(dá)重組人乳鐵蛋白（Recombinant Human Lactoferrin，rHLF）的純化方法［15］；李由等通過重組蛋白和主要牛蛋白雜質(zhì)的物化性質(zhì)，計算制定了純化工藝 路線；采用硫酸銨沉淀去除IgG蛋白，進(jìn)一步通過疏水層析的條件優(yōu)化分離同源LA蛋白得到重組人乳清白蛋白純品［16］。田陽等以離子交換、疏水作用、HPLC和凝膠過濾層析等方法對山羊乳腺生物反應(yīng)器表達(dá)的人促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）進(jìn)行分離純化并獲得96%以上的純品［17］。

4 問題和展望

雖然近年來乳腺生物反應(yīng)器的研究取得很多突破性進(jìn)展，但是它作為一個不太成熟的新興產(chǎn)物還存在很多問題。①轉(zhuǎn)基因動物前期研究投入大，成功率較低；②外源基因的改造及克隆等轉(zhuǎn)基因技術(shù)還不夠成熟；③目的基因的表達(dá)水平總體不高，表達(dá)量低，受位置效應(yīng)制約；④獲得的目標(biāo)蛋白與自然活性蛋白可能存在一定的差異性，后期的分離純化技術(shù)還不成熟；⑤轉(zhuǎn)基因方式獲得的蛋白對人體是否會產(chǎn)生不良影響也未可知。盡管乳腺生物反應(yīng)器這種新型轉(zhuǎn)基因技術(shù)還存在各種缺陷，隨著研究的深入，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完善和開發(fā)，我們有理由相信在不久的將來，乳腺生物反應(yīng)器必將獲得成功和產(chǎn)業(yè)化，對人類的生活和生產(chǎn)產(chǎn)生巨大的影響。

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