楊 榕，范晨玲，畢 美，宋西珠，李玉姝*，單忠艷，滕衛(wèi)平

0 引言

自身免疫性甲狀腺炎(Autoimmune thyroiditis,AIT)是器官特異性自身免疫性疾病，從免疫學(xué)視角探索,本病發(fā)病機(jī)制是體液免疫和細(xì)胞免疫共同作用的結(jié)果，如T細(xì)胞功能的異常和甲狀腺自身抗體的產(chǎn)生[1]。研究證實，AIT是由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)發(fā)生，并以甲狀腺內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤和血清中存在甲狀腺特異性自身抗體為特征。最近，學(xué)者們開始越來越多地關(guān)注CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、Th17細(xì)胞在多種自身免疫性疾病中的作用，研究它們的功能、分化機(jī)制對于深入認(rèn)識機(jī)體免疫調(diào)節(jié)規(guī)律，理解疾病發(fā)病機(jī)制，尋求更有效的疾病干預(yù)靶點具有非常重要的意義。NOD.H-2h4小鼠是研究碘致自身免疫性甲狀腺炎的最理想的動物模型[2]。本研究利用碘誘導(dǎo)的NOD.H-2h4小鼠甲狀腺炎模型，觀察在AIT發(fā)生發(fā)展中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、Th17細(xì)胞的變化，以探討碘致NOD.H-2h4小鼠發(fā)生AIT的可能的免疫學(xué)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 NOD.H-2h4小鼠購自美國Jackson公司，在中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF實驗室內(nèi)飼養(yǎng)和繁殖。所有動物的飼養(yǎng)以及實驗均根據(jù)動物實驗指南并經(jīng)過動物倫理委員會的批準(zhǔn)。選取4周齡NOD.H-2h4雌鼠30只，體重20 g左右，隨機(jī)分為對照組15只(給予無菌雙蒸水)和高碘飲水組15只(給予含0.005%碘化鈉的無菌雙蒸水，相當(dāng)于正常碘攝入量的100倍)，每組動物分別于實驗開始后8周麻醉處死。

1.2 標(biāo)本采集 動物稱重后，10%水合氯醛麻醉，開胸心臟取血。頸部正中切口，分離皮膚和肌肉層，暴露氣管，顯露出甲狀軟骨側(cè)后方的兩葉甲狀腺。將氣管和甲狀腺一并取下，迅速剝離甲狀腺，冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，電子天平稱重。同時無菌條件下打開腹腔切取脾臟,剪開后大半脾放入含有PBS的EP管中，用于流式細(xì)胞術(shù)；小半放入含有RNAlater(Ambion,Austin,USA)的管中，-70 ℃儲存，用于實時定量RT-PCR。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)

1.3.1 小鼠脾臟單個核細(xì)胞的制備 將小鼠大半脾臟，在200目鋼網(wǎng)上研磨，用1 640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，離心，裂解，洗滌，確定活細(xì)胞超過90%，計數(shù)細(xì)胞，并將脾細(xì)胞終濃度調(diào)至1×107/mL。

1.3.2 小鼠脾細(xì)胞的培養(yǎng) 于24孔培養(yǎng)板加入細(xì)胞懸液，每只鼠接種6個孔。其中兩孔收集細(xì)胞懸液，待測細(xì)胞CD4、CD25和Foxp3抗原的表達(dá)。另兩孔加乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)5 μL/孔，離子霉素1 μL/孔；在37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)1 h后，再加入布雷菲德菌素(BFA)10 μL/孔繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集細(xì)胞，待測CD4、IL-17抗原的表達(dá)。余孔作為熒光染色的對照。

1.3.3 流式細(xì)胞染色 ①Treg的免疫熒光染色：細(xì)胞從孔中吸出轉(zhuǎn)入流式管，洗滌，離心，棄上清；加入熒光抗體 CD4-FITC、CD25-APC，4 ℃避光孵育，洗滌，離心，棄上清，震蕩混勻。表面染色后固定、破膜加入抗體Foxp3-PE，重復(fù)上述步驟后加染色buffer，立即應(yīng)用FACScan流式細(xì)胞儀(BD Biosciences,USA)進(jìn)行流式細(xì)胞分析。數(shù)據(jù)經(jīng)winMDI 2.9分析軟件處理。②Th17細(xì)胞免疫熒光染色：步驟同上，表面染色加入熒光抗體 CD4-FITC，胞內(nèi)染色加入抗體IL-17-PE (以上單克隆抗體均購自BD Bioscience,USA)。

1.4 甲狀腺組織的光鏡形態(tài)學(xué) 小鼠甲狀腺組織經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色。采用BX51FL+DP70 顯微照像系統(tǒng)，應(yīng)用Image-Pro Plus 5.1軟件測量100倍光鏡下濾泡腔平均面積、等效半徑、平均周長、形狀因子和上皮細(xì)胞高度、核長短徑比。淋巴細(xì)胞浸潤程度的評估參照文獻(xiàn)[3]，根據(jù)淋巴細(xì)胞浸潤面積，HE染色的甲狀腺組織切片按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分：0=正常;1+∶1%～10%;2+∶10%～30%;3+∶30%～50%;4+∶>50%。甲狀腺炎評分采用至少3塊非連續(xù)的甲狀腺組織切片的評分的均值表示。

1.5 血清中TgAb滴度的測定 通過心臟取血的小鼠室溫靜置至少2 h，離心后分離血清并儲存于-70 ℃的冰箱內(nèi)待用。小鼠甲狀腺組織勻漿并離心后，應(yīng)用鹽析法分離小鼠甲狀腺球蛋白(MTg)，并用重復(fù)凝膠過濾的方法進(jìn)行純化。應(yīng)用抗原介入的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗測定TgAb，TgAb>0.082確定為陽性。

1.6 實時定量RT-PCR分析

1.6.1 脾組織總RNA的提取 應(yīng)用TRIzol 試劑(Invitrogen,USA)抽提脾組織總RNA。應(yīng)用核酸定量儀測定各RNA樣品濃度及其260/280 nm波長處吸光度比值在1.9～2.1之間。

1.6.2 合成互補(bǔ)DNA(cDNA) 應(yīng)用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit,TaKaRa)將1 μg總RNA于PCR儀中(ABI 9700 PCR meter)反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)。Real-Time RT-PCR：以GAPDH為參比基因，對目的基因Foxp3、IL-17、RORγt進(jìn)行實時定量檢測，應(yīng)用SYBR?PremixExTaqTMⅡ試劑盒(Takara)于Lightcycler480實時定量PCR儀上(Roche)采用SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR法對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系為18 μL，引物設(shè)計與合成：GAPDH：5′-AAGCCTGACCACGCTTTCTA-3′(上游) 和 5′-ATGAAGTGGTTGGGGAATGA-3′(下游)；Foxp3：5′-GGC CCT TCT CCA GGA CAG A-3′(上游)和5′-GCT GAT CAT GGC TGG GTT GT-3′(下游)；IL-17：5′-AGGCTCAGCAGCAACAG-3′(上游)和5′-ACGCGCAAACATGTCCAG-3′(下游)；RORγt：5′-ACC TCC ACT GCC AGC TGT GTG CTG TC-3′(上游)和5′-TCA TTT CTG CAC TTC TGC ATG TAG CC-3′(下游)。上述引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，45 個循環(huán);75～95 ℃熔解曲線分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 甲狀腺相對重量 隨著周齡的增長，小鼠的體重逐漸增加，但是兩組小鼠體重沒有明顯差異。飲用高碘水8周后的NOD.H-2h4小鼠甲狀腺相對重量(12.04±0.36)mg較同周齡對照組小鼠(8.00±0.22)mg明顯增加(P<0.001)。增大的甲狀腺組織與正常甲狀腺相比顏色變淺、質(zhì)地變硬。

注：小鼠甲狀腺相對重量=小鼠甲狀腺濕重(mg)/小鼠體重(g)×100。

2.2 血清TgAb滴度的變化 NOD.H-2h4小鼠在予高碘飲水8周后，血清TgAb滴度(OD=0.70±0.10*)較同周齡對照組(OD=0.48±0.08)顯著升高(P<0.001)。

2.3 甲狀腺炎癥評估 HE染色結(jié)果顯示，給予高碘飲水8周后，NOD.H-2h4小鼠甲狀腺炎的發(fā)生率增高，如表1所示。

表1 NOD.H-2h4小鼠補(bǔ)碘與未補(bǔ)碘組甲狀腺炎發(fā)生率(%)

通過觀察HE染色切片，根據(jù)淋巴細(xì)胞浸潤情況對甲狀腺炎癥程度進(jìn)行評分顯示，給碘8周甲狀腺內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤程度明顯增加，組織學(xué)炎癥評分明顯增高。雖然未補(bǔ)碘組部分小鼠也自發(fā)產(chǎn)生甲狀腺炎，但是炎癥程度評分均較低，見圖1及表2。

表2 NOD.H-2h4小鼠補(bǔ)碘與未補(bǔ)碘組甲狀腺炎癥程度組織學(xué)評分

圖1 NOD.H-2h4小鼠甲狀腺濾泡光鏡結(jié)構(gòu) HE染色(×100)

2.4 流式細(xì)胞結(jié)果分析

2.4.1 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例的變化 小鼠脾細(xì)胞CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞流式分析過程如圖2所示。高碘飲水組小鼠8周以后脾細(xì)胞CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞百分比與同周齡對照組比較明顯降低[(13.99± 2.19)%vs.(16.97± 3.47)%,P<0.01]。

圖2 NOD.H-2h4小鼠高碘組與對照組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的流式細(xì)胞學(xué)分析

2.4.2 Th17細(xì)胞比例的變化 小鼠脾細(xì)胞Th17細(xì)胞流式分析過程如圖3所示。高碘飲水組小鼠8周以后脾細(xì)胞中CD4+IL-17+的Th17細(xì)胞百分比與同周齡對照組比較明顯升高。見表3。

圖3 NOD.H-2h4小鼠高碘組與對照組Th17細(xì)胞的流式細(xì)胞學(xué)分析

表3兩組流式細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果(細(xì)胞比例，%)

細(xì)胞高碘組對照組P值Treg13.99± 2.1916.97± 3.47<0.01Th172.27± 0.890.71± 0.26<0.01

2.5 實時定量結(jié)果分析

2.5.1 Foxp3 mRNA表達(dá)水平的變化 高碘飲水8周后，AIT小鼠脾組織Foxp3 mRNA表達(dá)水平低于同周齡對照組小鼠，見表4。

2.5.2 IL-17 mRNA 表達(dá)水平的變化 高碘飲水8周后，AIT小鼠脾組織IL-17 mRNA表達(dá)水平高于同周齡對照組小鼠，見表4。

2.5.3 RORγt mRNA表達(dá)水平的變化 高碘飲水8周后，AIT小鼠脾組織RORγt mRNA表達(dá)水平高于同周齡對照組小鼠，見表4。

表4 NOD.H-2h4小鼠脾細(xì)胞各因子mRNA 表達(dá)量的變化

3 討論

NOD.H-2h4小鼠是研究碘致自身免疫性甲狀腺炎的最理想的動物模型[2]，當(dāng)給予7～8周齡NOD.H-2h4小鼠0.05%碘化鈉水8周后，幾乎100%NOD.H-2h4小鼠發(fā)生SAT[4]。本實驗亦提示碘過量可以誘發(fā)和加重具有自身免疫遺傳傾向的易感動物發(fā)生AIT。盡管公認(rèn)NOD.H-2h4小鼠是建立SAT模型的一種良好的動物品系，但是發(fā)生SAT的確切免疫學(xué)機(jī)制尚未闡明。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一群具有免疫抑制效應(yīng)的T細(xì)胞亞群，其對維持機(jī)體免疫耐受和免疫應(yīng)答具有非常重要的作用，可以通過一系列機(jī)制抑制過強(qiáng)的免疫應(yīng)答，使機(jī)體在自身損傷最小的情況下有效地清除抗原或病原體。Treg作為一種獨特的具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞亞群，參與了機(jī)體外周自身免疫耐受的建立和維持[5]。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)生和功能發(fā)揮著關(guān)鍵的分子開關(guān)的作用，屬于叉頭翼狀螺旋家族。在小鼠中，外周和胸腺的Foxp3+細(xì)胞大部分為CD4+CD25+T細(xì)胞，F(xiàn)oxp3的遺傳缺陷可以造成CD4+CD25+T細(xì)胞的減少，從而導(dǎo)致自身免疫異常的發(fā)生[6-7]。應(yīng)用CD25抗體在給予NOD.H-2h4小鼠高碘飲水前4 d，將小鼠體內(nèi)的CD4+CD25+T細(xì)胞去除后，發(fā)現(xiàn)發(fā)生甲狀腺炎的程度和血清TgAb滴度均較對照組加重[8]。如果在去除CD25+T細(xì)胞的B10小鼠體內(nèi)被動轉(zhuǎn)入CD4+CD25+T細(xì)胞，則能恢復(fù)其對實驗性自身免疫性甲狀腺炎(EAT)的抵抗[9]。最近的研究報道，可以用小鼠甲狀腺球蛋白(mTg)在抵抗甲狀腺炎發(fā)生的小鼠體內(nèi)去除CD4+CD25+Treg后，誘導(dǎo)其發(fā)生甲狀腺炎[10]。自然存在的CD4+CD25+Foxp3+Treg在誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受中發(fā)揮著重要的作用[11]，同時能夠影響易感小鼠甲狀腺炎的發(fā)生。在本項研究中，我們發(fā)現(xiàn)，通過高碘飲水誘導(dǎo)發(fā)生SAT的NOD.H-2h4小鼠，外周CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例較同周齡對照組降低。同時，F(xiàn)oxp3 mRNA的表達(dá)亦有類似的變化。缺乏Foxp3的功能性表達(dá)可能導(dǎo)致本應(yīng)發(fā)育為Treg的胸腺T細(xì)胞分化為自身反應(yīng)性T細(xì)胞，并逃避陰性選擇，攻擊自身抗原而導(dǎo)致自身免疫性疾病[12]。結(jié)合以往研究結(jié)果，提示在小鼠甲狀腺炎的發(fā)生中，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，為治療提供一個新的靶點。

長期以來，學(xué)者們認(rèn)為，Th1細(xì)胞介導(dǎo)多種自身免疫性疾病的發(fā)生。而Park等[13]對EAE動物模型的研究同樣發(fā)現(xiàn)：清除或中和Th1型細(xì)胞因子IFN-γ或IL-12的功能，并不能預(yù)防或減輕疾病的進(jìn)展。而IL-23的缺失降低了體內(nèi)IL-17+T細(xì)胞的比例，因此延緩了疾病的進(jìn)程。Langrish等[14]在定向基因敲除動物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-23基因缺失的小鼠可以抵抗EAE的發(fā)生。在該動物模型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和引流淋巴結(jié)中，IFN-γ+CD4+T細(xì)胞數(shù)量與野生型小鼠相當(dāng)，而IL-17、TNF-α和IL-6+CD4+細(xì)胞卻檢測不到。在隨后的研究中，給予EAE小鼠抗IL-17抗體處理，可以延緩EAE所致麻痹的發(fā)生，并使已經(jīng)發(fā)生的麻痹明顯減輕。以上研究說明缺失IL-17+T細(xì)胞可以使EAE的發(fā)病受到抑制，從而提示IL-17+T細(xì)胞誘導(dǎo)自身免疫病的發(fā)生。Th17分泌細(xì)胞因子IL-17，RORγt是Th17細(xì)胞分化調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其過表達(dá)可以誘導(dǎo)IL-17的產(chǎn)生，而缺乏RORγt的細(xì)胞只產(chǎn)生少量的IL-17[15]。以往在多種自身免疫病及相應(yīng)動物模型的血清及組織中均能檢測到IL-17。IL-17通過誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)、趨化因子等導(dǎo)致組織器官的炎性損傷。最近，大量研究證實在組織慢性炎癥中Th17細(xì)胞的致病作用，并且已經(jīng)證實在部分動物模型中的器官特異性或非器官特異性自身免疫病的發(fā)病機(jī)制中Th17細(xì)胞亦發(fā)揮著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，高碘誘發(fā)的NOD.H-2h4自身免疫性甲狀腺炎小鼠模型中Th17細(xì)胞比例較同周齡對照組小鼠明顯升高。同時，IL-17 mRNA、RORγt mRNA的表達(dá)亦有類似的變化。提示在AIT的發(fā)生發(fā)展中Th17細(xì)胞發(fā)揮著重要的作用。Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子介導(dǎo)炎癥性反應(yīng)，可能參與多種自身免疫性疾病的重要發(fā)病環(huán)節(jié)。Th17細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)拓寬了我們對AIT發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，對尋求更有效的疾病干預(yù)靶點具有非常重要的意義。

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