馮婭妮，石 強，孫艷紅

0 引言

腦缺血再灌注損傷最初可出現(xiàn)腦血流降低，導致發(fā)生膜去極化。除氯胺酮外，幾乎所有麻醉藥都劑量相關(guān)性地減少腦代謝活動，推遲膜去極化發(fā)生的作用。缺血再灌注后繼發(fā)氧自由基釋放、興奮性氨基酸釋放增加、凋亡基因激活及血腦屏障的破壞等嚴重損傷腦組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。丙泊酚與氧自由基反應(yīng)，以低活性的自由基取代了高活性的自由基，減輕脂質(zhì)過氧化級聯(lián)反應(yīng)，成為其神經(jīng)保護作用的重要機制[1]。已有研究表明，單次異丙酚預(yù)處理能夠減輕大鼠缺氧/復(fù)氧引起的海馬神經(jīng)元的損傷,而多次藥物預(yù)處理是否增強腦保護的效果尚不清楚[2-4]。因此，本研究擬探討不同劑量異丙酚預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧損傷的海馬神經(jīng)元作用及神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor,NGF)及其受體的作用,為異丙酚的神經(jīng)保護作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 神經(jīng)元的培養(yǎng) 出生時間<24 h新生SD大鼠，體重5～6 g,由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供，用75%酒精浸泡消毒后迅速斷頭，沿大腦中縫剪開左右半球，分別取兩側(cè)大腦，在解剖顯微鏡下分離出海馬。將海馬組織塊移入0.125%胰蛋白酶(Sigma公司，美國)的解剖液中，在含9.5%CO2的孵箱中36.5 ℃消化30 min。以5×105個/min的神經(jīng)元密度接種在直徑35 mm無菌培養(yǎng)皿或孔板中(Coster公司，美國)，2 mL/皿或100 μL/孔，置于含10%CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)9 d。

1.2 分組及處理 以海馬神經(jīng)元培養(yǎng)皿或孔板為觀察單位，隨機分為7組：對照組(Con組)，未做任何處理；CoCl2組(CoCl2組)：加入300 μm的CoCl2處理1 h，然后更換正常的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，之后更換無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；脂肪乳劑組(Intra組)，培養(yǎng)孔中加入10%脂肪乳劑90 μL(四川樂山裕恒藥業(yè)公司，批號：0010801)；異丙酚組(Prop組)(AstraZenca，批號：CN066)培養(yǎng)孔中加入用DMEM稀釋至終濃度10、20、50、100 μM的異丙酚1 h后，其余處理同CoCl2組。用RT-PCR檢測NGF mRNA和TrkA mRNA的表達。為進一步研究NGF/TrkA 在異丙酚預(yù)處理中的作用，本研究將海馬神經(jīng)元細胞分為4組，分別為對照組(Con組)，CoCl2組，50 μM濃度的異丙酚組，1.0 μmol/L K252a組，用Western blot檢測TrkA 蛋白表達。

1.3 MTT自動比色法檢測神經(jīng)元活力 每組36孔，每孔加MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL 二甲亞砜(DMSO)，振蕩15 min，選擇490 nm波長測OD值以判斷細胞活力。

1.4 流式細胞法檢測細胞凋亡 將神經(jīng)元接種于6孔板，按“1.2”項方法進行分組，PBS洗滌后吹打成單細胞懸液，以PBS沖洗2次，70%預(yù)冷乙醇4 ℃下懸浮固定細胞，-20 ℃過夜，PBS洗滌2遍，用10 mg/L PI和1 g/L RNaseA,40 ℃避光染色30 min,上流式細胞儀檢測，每一實驗組檢測6份標本，Cellfit軟件收集10 000個細胞，CellQuest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)，記錄AP區(qū)亞峰細胞百分率，即為細胞凋亡百分率。

1.5 RT-PCR檢測異丙酚預(yù)處理后NGF mRNA和 TrkA mRNA的表達變化 分別在預(yù)處理后24 h收集細胞提取RNA。采用TRAZOL 試劑盒，RNA的逆轉(zhuǎn)錄采用PROMEGA 公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，采用隨機寡聚六磷酸核苷酸引物合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)對照。特異性引物序列和of 180 base pairs(bp);TrkA:sense′-GGTACCAGCTCTCCAACACTGAGG-3′antisense,5′-CCAGAACGTCCAGGTAACTCGGTG-3′product size of 260 base pairs(bp);PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠進行電泳,在凝膠分析成像系統(tǒng)進行半定量的分析。

1.6 Western blot法檢測TrkA蛋白的表達 免疫沉淀Western blot 技術(shù):吸去細胞培養(yǎng)液，用冰冷PBS 輕輕沖洗，收獲細胞后抽提細胞總蛋白，BCA 法蛋白定量后將蛋白濃度調(diào)至等濃度。以30 μg 的蛋白樣本經(jīng)10%的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，再轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉印跡膜2 h。加入各抗體，4 ℃孵育過夜，洗膜，再用辣根過氧化物酶標記相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h。ECL 化學發(fā)光系統(tǒng)檢測反應(yīng)產(chǎn)物信號。同一張印跡膜曝光后，以0.5%的十二烷基硫酸鈉洗脫一抗，再與相應(yīng)總蛋白抗體孵育雜交，所得結(jié)果作為內(nèi)參對照。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度異丙酚預(yù)處理對海馬神經(jīng)元活力的影響 經(jīng)過濃度為50 μM的異丙酚預(yù)處理后，在無血清培養(yǎng)條件下，海馬神經(jīng)元的活力比無預(yù)處理組明顯增高(P<0.01),10、20、100 μM濃度的異丙酚預(yù)處理后，與缺氧/復(fù)氧組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，脂肪乳劑組與單純?nèi)毖?復(fù)氧組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 不同濃度異丙酚預(yù)處理對海馬神經(jīng)元凋亡的影響 50 μM的異丙酚預(yù)處理后，海馬神經(jīng)元的凋亡比無預(yù)處理組明顯減少(P<0.01),10、20、100 μM濃度的異丙酚預(yù)處理后與缺氧/復(fù)氧組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，脂肪乳劑組與單純?nèi)毖?復(fù)氧組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 異丙酚預(yù)處理對各組海馬神經(jīng)元細胞缺氧/復(fù)氧后細胞活力和細胞凋亡的變化

2.3 不同濃度的異丙酚預(yù)處理對NGF mRNA和 TrkA mRNA表達的影響 50 μM的異丙酚預(yù)處理使NGF mRNA及 TrkA mRNA的表達水平上調(diào)(P<0.01或P<0.05 ),10、20、100 μM的異丙酚預(yù)處理后與缺氧/復(fù)氧組相比，NGF mRNA和TrkA mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1、圖2。

圖1 不同濃度異丙酚預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧損傷的海馬神經(jīng)元NGF mRNA表達的影響

圖2 不同濃度異丙酚預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧損傷的海馬神經(jīng)元TrkA mRNA表達的影響

2.4 K252a對異丙酚預(yù)處理的影響 1.0 μmol/L K252a 使TrkA 蛋白的表達水平下調(diào)(P<0.01)，同時使異丙酚預(yù)處理對海馬神經(jīng)元的保護作用消失,細胞活力降低(P<0.05)。見圖3、圖4。

圖3 K252a對TrkA蛋白表達的影響表達的影響

圖4 K252a對海馬神經(jīng)元細胞活力的影響

3 討論

大量的研究表明,異丙酚具有中樞保護作用，但其機制仍不十分明確。本研究表明，用50 μM異丙酚預(yù)處理對海馬神經(jīng)元細胞缺氧/復(fù)氧損傷有保護作用，這種保護作用是異丙酚通過誘導神經(jīng)因子NGF及其受體TrkA的表達來完成的。

目前研究腦缺血再灌注損傷多采用動物模型，本研究從細胞水平進行腦保護的研究，用CoCl2模擬乏氧刺激，建立了一種簡便細胞乏氧模型。CoCl2是現(xiàn)在比較公認的化學乏氧的模擬物,可以誘導低氧過程的關(guān)鍵因子低氧誘導因子1-α的上調(diào)，從而調(diào)節(jié)低氧的諸多效應(yīng)基因的表達變化[5]。我們在實驗中用300 μM CoCl2處理神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)細胞的增殖下降和凋亡增高。

研究表明，異丙酚在10～100 μmol/L已表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性[6]，本研究分別用10、20、50、100 μM的異丙酚對海馬神經(jīng)元進行預(yù)處理，結(jié)果顯示，50 μM異丙酚預(yù)處理后，明顯增加海馬神經(jīng)元的活力，減少凋亡。因為異丙酚溶于10%脂肪乳劑中，為排除脂肪乳劑的影響，本研究以10%脂肪乳劑作為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂肪乳劑不影響海馬神經(jīng)元的凋亡。NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一,神經(jīng)營養(yǎng)因子不僅調(diào)節(jié)發(fā)育過程中神經(jīng)元的存活,而且能夠阻止成年神經(jīng)元損傷后神經(jīng)元的死亡等許多神經(jīng)系統(tǒng)功能[7-9]。高親和力NGF受體TrkA是NGF的功能性受體,是啟動傳遞NGF生物效應(yīng)的信息物質(zhì)。NGF、TrkA對維持損傷神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)、促進神經(jīng)生長和修復(fù)具有重要作用,腦缺血損傷后應(yīng)用外源性神經(jīng)營養(yǎng)，不僅可減輕神經(jīng)元損傷,而且可促進運動、感覺軸突再生和神經(jīng)功能的恢復(fù)[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，海馬神經(jīng)元缺氧/復(fù)氧損傷后，NGF mRNA及TrkA mRNA表達明顯減少，50 μM異丙酚預(yù)處理明顯增加NGF及TrkA的表達，細胞活性增加，凋亡減少。TrkA阻斷劑 K252a 下調(diào)TrkA 蛋白的表達水平(P<0.01)，同時使異丙酚預(yù)處理對海馬神經(jīng)元的保護作用消失,細胞活力降低。因此可推斷，50 μM異丙酚預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧后的大鼠海馬神經(jīng)元有保護作用，NGF及其受體TrkA在異丙酚的預(yù)處理中起到重要的作用。

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