幽門螺桿菌生物膜形成與其耐藥機(jī)制的相關(guān)性

胡玢婕，趙付菊，趙 虎

(復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200040)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)是一種螺旋形、微需氧的革蘭陰性病原菌，其在人類胃表面黏膜上皮細(xì)胞和黏液層的長期定植是慢性活動性胃炎和消化性潰瘍的主要發(fā)病原因，也是導(dǎo)致胃部惡性腫瘤以及黏膜相關(guān)性淋巴組織淋巴瘤(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma，MALT)的重要危險(xiǎn)因子[1]。流行病學(xué)研究顯示，盡管幽門螺桿菌相關(guān)疾病的發(fā)病率為15%，但世界范圍內(nèi)一半以上的人口(在發(fā)展中國家高達(dá)80%)攜帶此菌[2]。幽門螺桿菌的難以根除和耐藥性菌株的日益增多存在多種原因，其耐藥性與其在感染部位形成生物膜(biofilm)的密切聯(lián)系已引起了廣泛關(guān)注。我們主要對幽門螺桿菌生物膜的結(jié)構(gòu)和形成發(fā)展、其與耐藥機(jī)制的相關(guān)性以及臨床防治幽門螺桿菌持續(xù)難治性感染的研究進(jìn)展做一綜述分析。

一、細(xì)菌生物膜的一般性質(zhì)

細(xì)菌生物膜是細(xì)菌在生長過程中為適應(yīng)生存環(huán)境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一種與浮游態(tài)細(xì)菌相對應(yīng)的生長方式[3]。生物膜細(xì)菌與浮游態(tài)細(xì)菌最主要的差別在于菌體排列緊密并包裹在自身分泌的胞外多糖基質(zhì)(extracellular polymeric substance，EPS)內(nèi)。這種基質(zhì)能夠改變菌體的表面性質(zhì)，從而促進(jìn)菌體在活性表面初始的黏附，同時(shí)防止細(xì)菌的過度聚集。

生物膜的形成是細(xì)菌發(fā)育序列在相關(guān)基因嚴(yán)格調(diào)控下的表達(dá)過程，其生長周期包括最初的定植、不可逆的黏附、結(jié)構(gòu)分化、發(fā)展成熟和解聚再定植5個(gè)階段[4]。在含有同種細(xì)菌的生物膜內(nèi)，表層菌容易獲得營養(yǎng)和氧氣并排出代謝產(chǎn)物，具有旺盛的生命活動，而接近基質(zhì)的深層菌則處于緩慢生長或不生長的休眠靜止?fàn)顟B(tài)。細(xì)菌之間能夠通過菌體產(chǎn)物來實(shí)現(xiàn)信息傳遞，包括細(xì)菌素、高絲氨酸內(nèi)酯、分泌蛋白等代謝產(chǎn)物和部分遺傳物質(zhì)在內(nèi)的信號分子能夠改變生物膜內(nèi)的種群分布，改變相鄰細(xì)胞蛋白的表達(dá)，將某些遺傳特性(如耐藥性)傳遞給鄰近細(xì)胞。因此，細(xì)菌生物膜并不是簡單被動的表面黏附和細(xì)胞聚集，而是一種由基因組和環(huán)境互相影響決定的具有結(jié)構(gòu)性、協(xié)調(diào)性和功能性的動態(tài)生物系統(tǒng)。

細(xì)菌生物膜的特性決定了其強(qiáng)大的環(huán)境適應(yīng)能力。具有生物膜形成能力的細(xì)菌引起的機(jī)體持續(xù)性炎癥反應(yīng)和組織損傷被認(rèn)為是慢性感染形成或惡化的原因[5];同時(shí)，這種由生物膜細(xì)菌引起的感染可抵抗宿主自身防御系統(tǒng)的免疫效應(yīng)，并且對抗菌藥物表現(xiàn)出逐漸增高的耐受能力[6]。

二、幽門螺桿菌生物膜的形成與發(fā)展

(一)幽門螺桿菌生物膜的組成成分

在Marshall和Warren首次成功培養(yǎng)和分離幽門螺桿菌[7]15 年后，Stark 等[8]觀察到幽門螺桿菌NCTC11637(ATCC43504)菌株在玻璃發(fā)酵瓶中生長時(shí)在氣液界面產(chǎn)生了一層不溶于水(含多糖)的被膜結(jié)構(gòu)，證實(shí)了幽門螺桿菌同樣具有形成生物膜的能力。而在近期的一項(xiàng)研究中，研究人員對從消化道潰瘍患者分離的幽門螺桿菌TK1402株生物膜的掃描電鏡結(jié)果顯示，生物膜是細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸聚集形成多分層結(jié)構(gòu)的前體[9]。這種性質(zhì)與具有典型生物膜結(jié)構(gòu)的銅綠假單胞菌生長方式相似，同時(shí)也觀察到幽門螺桿菌生物膜中含有與銅綠假單胞菌生物膜基質(zhì)中外膜囊泡(outer membrane vesicle，OMV)產(chǎn)物相類似的成分。

1.幽門螺桿菌生物膜中的蛋白質(zhì)成分Yonezawa等[10]培養(yǎng)了8株不同的幽門螺桿菌，并提取其生物膜結(jié)構(gòu)、分離OMV，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)條帶顯示了一種22 000蛋白的存在，這種蛋白在OMV培養(yǎng)的第2天才開始出現(xiàn)，且僅出現(xiàn)在TK1402株的SDS-PAGE條帶中。與此同時(shí)，他們測定了這種蛋白的N端氨基酸序列，測序結(jié)果顯示其N末端5個(gè)氨基酸殘基序列為[VDFSK]，但對于該蛋白鑒定、分離純化和化學(xué)性質(zhì)分析的工作成果仍未見報(bào)道。另外，研究人員也發(fā)現(xiàn)OMV存在于細(xì)菌和基質(zhì)的交界面以及生物膜胞外間隙，推測OMV在幽門螺桿菌生物膜基質(zhì)的產(chǎn)生和其黏附于細(xì)胞表面的最初階段發(fā)揮了重要作用。

Yang等[11]選擇了幽門螺桿菌(ATCC 43504)進(jìn)一步研究幽門螺桿菌生物膜的蛋白組成。該研究構(gòu)建了生物膜部分蛋白質(zhì)上調(diào)的缺失突變模型并對其特征進(jìn)行描述，同時(shí)利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatograph-mass spectrometer-computer，GC-MS)和核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)分析萃取的胞外多糖;結(jié)果顯示一種1，4-甘露糖蛋白聚糖參與了生物膜的形成過程，而生物膜中粒細(xì)胞活化蛋白A(neutrophil-activating protein A，NapA)上調(diào)現(xiàn)象的存在使幽門螺桿菌表現(xiàn)出細(xì)胞聚集結(jié)構(gòu)的減少和生物膜黏附能力的增強(qiáng)。

2.幽門螺桿菌生物膜中的糖類成分 檢測連續(xù)培養(yǎng)的幽門螺桿菌生物膜材料產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胞外多糖的產(chǎn)物具有很高的碳/氮比例[8]。粗提取幽門螺桿菌進(jìn)行碳水化合物分析，C14和C16脂類、N-乙酰氨基葡萄糖、海藻糖、葡萄糖、半乳糖和甘油酸甘露庚糖等幽門螺桿菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的組成成分普遍存在。而另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，幽門螺桿菌在釋放OMV的同時(shí)，也會釋放空泡毒素(vacuolating cytotoxin，VacA)、脲酶、LPS和其他外膜蛋白于OMV表面，證實(shí)了幽門螺桿菌生物膜是蛋白質(zhì)和碳水化合物相互依賴的復(fù)合基質(zhì)，為細(xì)菌在胃外環(huán)境中的生存提供了“保護(hù)性港灣”[11]。

3.幽門螺桿菌生物膜中的遺傳物質(zhì) 與大多數(shù)細(xì)菌生物膜含有遺傳物質(zhì)成分相似，幽門螺桿菌生物膜中也存在一定數(shù)量的胞外DNA(extracellular DNA，eDNA)。Grande 等[12]利用DNA印跡法和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA聚合酶鏈反應(yīng)(random amplification of polymorphic DNA-PCR，RAPD-PCR)分析培養(yǎng)2 d的幽門螺桿菌生物膜基質(zhì)，首次發(fā)現(xiàn)了長度為 9 416 bp的 eDNA，而eDNA與胞內(nèi)DNA具有不同的分子結(jié)構(gòu)，表明eDNA釋放的最初來源并不是細(xì)胞溶解;另外他們在培養(yǎng)基中加入DNase I，但DNase I對生物膜的生長成熟并沒有顯著影響。因此eDNA不是幽門螺桿菌生物膜的主要組成部分，而是參與了基因重組的過程，從而造成種群基因的多樣性。eDNA在生物膜形成初期被OMV保護(hù)，有利于細(xì)菌之間活躍動態(tài)的信息交換，是基因水平轉(zhuǎn)移主要的信號分子。

(二)幽門螺桿菌生物膜形成的影響因素

對細(xì)菌生物膜形成動力學(xué)研究的大量實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)菌的自動聚集、運(yùn)動性和疏水性是生物膜形成的重要因素[13-14]。然而，Yonezawa 等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，這些因素對生物膜形成能力很強(qiáng)的幽門螺桿菌TK1402菌株并沒有顯著的影響。而TK1402菌株在細(xì)胞過度生長時(shí)出現(xiàn)了生物膜合成的減少，但轉(zhuǎn)入含有7%胎牛血清的布氏肉湯中則恢復(fù)了很強(qiáng)的生物膜合成能力。因此可認(rèn)為細(xì)菌生長是幽門螺桿菌生物膜合成的重要影響因素。

(三)幽門螺桿菌生物膜形成相關(guān)的密度感應(yīng)系統(tǒng)

細(xì)菌生物膜的形成是一個(gè)動態(tài)演化過程。生物膜中的細(xì)菌在生長過程中會分泌一種或多種誘導(dǎo)分子到外環(huán)境中。隨著細(xì)菌數(shù)量的增加，其分泌信號分子的濃度也隨之增加。當(dāng)濃度達(dá)到一定的閾值時(shí)可激發(fā)一系列特定的基因表達(dá)，以調(diào)節(jié)細(xì)菌的群體行為，這種現(xiàn)象稱為密度感應(yīng)(quorum sensing，QS)[16]。QS 系統(tǒng)是細(xì)菌之間信號傳遞的一種重要機(jī)制，細(xì)菌通過感應(yīng)這些誘導(dǎo)分子來判斷菌群密度和周圍環(huán)境變化，避免細(xì)菌因過度生長而造成空間和營養(yǎng)物質(zhì)缺乏;更重要的是通過QS系統(tǒng)共同對周圍環(huán)境刺激做出反應(yīng)，極大提高了整個(gè)細(xì)菌群體的生存能力[17]。

1.幽門螺桿菌中的QS系統(tǒng) 幽門螺桿菌中存在革蘭陽性和陰性細(xì)菌共同的LuxS/自身誘導(dǎo)素2(autoinducer-2，AI-2)QS系統(tǒng)。AI-2作為其信號分子具有高度保守性，能被不同種屬細(xì)菌識別，其合成主要依賴于在許多菌屬中序列保守的luxS基因編碼的LuxS蛋白酶[18]。AI-2以密度依賴性方式在菌體環(huán)境中積累存在。當(dāng)AI-2增加到一定濃度時(shí)便可與luxS蛋白特異性結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)一系列下游基因如化學(xué)感受體基因tlpB、化學(xué)轉(zhuǎn)換基因cheA和cagE IV型分泌基因的表達(dá)，從而促使一系列效應(yīng)產(chǎn)物的生成。目前的研究已發(fā)現(xiàn)受體LuxQP途經(jīng)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子LsrB途經(jīng)和RbsB蛋白途經(jīng)3種AI-2的感應(yīng)調(diào)控機(jī)制。但這些途經(jīng)的通路在幽門螺桿菌中的作用仍需更深入的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。關(guān)于AI-2在幽門螺桿菌中調(diào)節(jié)作用的最新報(bào)道來自Rader等[19]的研究，細(xì)菌通過化學(xué)感應(yīng)受體tlpB將AI-2作為化學(xué)排斥劑來感應(yīng)，這一作用與細(xì)菌的泳動功能相關(guān)。

2.QS系統(tǒng)在幽門螺桿菌生物膜形成中的作用 有研究顯示，當(dāng)檢測一種多個(gè)基因發(fā)生特定突變的幽門螺桿菌菌株產(chǎn)生的生物膜效應(yīng)時(shí)，luxS和cagE IV型分泌基因突變體形成的生物膜作用效率是野生型菌株的2倍[20]。分析其原因認(rèn)為，luxS基因的突變增加了幽門螺桿菌特異性生物膜的形成;另一方面，cagE IV型分泌系統(tǒng)形成巨大的膜孔使得部分蛋白通過該系統(tǒng)分泌。但對于幽門螺桿菌的生存，cag毒力島并非必需，轉(zhuǎn)錄該操縱子所需的額外能量消耗阻礙了生物膜的有效形成，而對cag基因的破壞則可能造成膜表面pH值和疏水性的改變，使得突變體具有更強(qiáng)的黏附能力。由此可推斷l(xiāng)uxS和cagE基因之間存在著相互作用，表明一定數(shù)量的基因?qū)τ谟拈T螺桿菌形成的生物膜的重要性。

另外，為了驗(yàn)證幽門螺桿菌感染導(dǎo)致的胃部疾病可能是生物膜頑固性的一種表現(xiàn)形式，Celini等[21]對幽門螺桿菌感染患者的胃組織進(jìn)行了活檢。他們發(fā)現(xiàn)，在幽門螺桿菌大量 S形形態(tài)之中，也存在球形形態(tài)菌嵌入基質(zhì)中。球形形態(tài)菌含有g(shù)lmM組成型基因。在對幽門螺桿菌陽性患者樣本的逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測顯示，所有g(shù)lmM陽性的樣本LuxS群體效應(yīng)相關(guān)基因同樣也是陽性。這也表明LuxS群體效應(yīng)是幽門螺桿菌生物膜形成的可靠指標(biāo)。

三、幽門螺桿菌生物膜的耐藥機(jī)制

根據(jù)目前的治療指南，幽門螺桿菌感染的根除治療主要有2種:含質(zhì)子泵抑制劑(protonpumpinhibitor，PPI)和2種抗菌藥物(克拉霉素和阿莫西林)的三聯(lián)療法[22]或含PPI、鉍劑、四環(huán)素、甲硝唑的四聯(lián)療法[23]。然而，隨著幽門螺桿菌對甲硝唑和克拉霉素耐藥的增加，這一傳統(tǒng)三聯(lián)療法對幽門螺桿菌的根除率在全世界范圍內(nèi)不斷下降。美國、南歐和部分亞洲國家對受試者意向治療(intention-to-treat，ITT)分析的大樣本臨床研究結(jié)果[24]顯示，該方案幽門螺桿菌根除率已下降至80%以下。大量研究表明，幽門螺桿菌生物膜的形成在很大程度上導(dǎo)致了耐藥菌株的增加，其耐藥機(jī)制主要有滲透與營養(yǎng)限制、對抗免疫防御系統(tǒng)、基因水平轉(zhuǎn)移和外排泵基因異常表達(dá)四種學(xué)說。

(一)滲透與營養(yǎng)限制

幽門螺桿菌生物膜基質(zhì)的屏障作用是這一機(jī)制的關(guān)鍵。作為一種蛋白質(zhì)和碳水化合物相互依賴的復(fù)合基質(zhì)，幽門螺桿菌生物膜EPS帶有的大量陰離子能通過氫鍵、共價(jià)鍵、范德華力吸附部分帶有陽離子的抗菌藥物;另外，EPS含有多種抗菌藥物降解酶，導(dǎo)致抗菌藥物的水解和鈍化滅活[5]。

另一方面，生物膜結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和其代謝活動造成深層菌不易獲得足夠的營養(yǎng)和氧氣，從而生長緩慢或處于休眠狀態(tài)。而大部分的抗生素主要針對代謝活躍的細(xì)菌，因此深層菌在很大程度上增強(qiáng)了幽門螺桿菌生物膜的耐藥性[25]。由于局部代謝產(chǎn)物的堆積使得深層菌處于偏酸的微環(huán)境中，需要中性理化環(huán)境的克拉霉素的抗菌活性在偏酸性的生物膜深層大大降低。抗菌藥物能夠很快地根除表層菌。但當(dāng)停藥后，殘存在深層的細(xì)菌可迅速繁殖形成新的生物膜，造成了臨床上感染的反復(fù)發(fā)作，難以治愈，也可能導(dǎo)致了生物膜對抗菌藥物耐受的遺傳性。

(二)對抗機(jī)體免疫防御系統(tǒng)

幽門螺桿菌生物膜的大量黏性基質(zhì)形成物理屏障，限制了吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的活性氧產(chǎn)物滲透進(jìn)入生物膜，導(dǎo)致吞噬細(xì)胞無法破壞生物膜內(nèi)細(xì)菌[26]。另外，包裹細(xì)菌的黏性基質(zhì)以及細(xì)菌釋放出的抗原性物質(zhì)刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的特異性抗體。這些抗體與可溶性抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，沉積在感染病灶周圍，與黏附菌體誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素8(interleukin 8，IL-8)[27]共同趨化大量中性粒細(xì)胞浸潤并釋放蛋白水解酶。這種免疫復(fù)合物效應(yīng)能引起宿主嚴(yán)重的免疫損害[26]，但卻無法對生物膜中的細(xì)菌起作用。

(三)基因水平轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer，HGT)

HGT是指在細(xì)菌生物膜中兩個(gè)不同菌株之間的基因傳遞。細(xì)菌生物膜的環(huán)境決定了其中常包含一種或多種共生的物種，而這成為了連接QS系統(tǒng)和生物膜的紐帶。有研究表明，2個(gè)不同的幽門螺桿菌菌株共培養(yǎng)時(shí)會表現(xiàn)出更高的黏附能力，存在更高的遺傳異質(zhì)性[28];另外，幽門螺桿菌也可能獲得其他物種誘導(dǎo)的防御機(jī)制，產(chǎn)生提高對宿主自然免疫殺傷耐受的外膜蛋白的能力，使得菌體下一代具有更好的適應(yīng)性和更強(qiáng)的毒力[29]。

(四)外排泵基因異常表達(dá)

細(xì)菌通過外排泵將抗菌藥物排出是產(chǎn)生多重耐藥性的重要機(jī)制。大量對幽門螺桿菌耐藥菌株外排泵系統(tǒng)的研究顯示，外排泵基因 hp605、hp971、hp1327和hp1489及其相應(yīng)mRNA的表達(dá)在生物膜中顯著上升[30]。這一發(fā)現(xiàn)表明幽門螺桿菌生物膜環(huán)境可能誘導(dǎo)了部分基因的異常表達(dá)，但機(jī)制尚未清楚。

四、針對幽門螺桿菌生物膜的防治策略進(jìn)展

(一)N-乙酰半胱氨酸 (N-acetylcysteine，NAC)治療

NAC作為一種粘蛋白溶解劑和含硫醇的抗氧化劑，在對抗以銅綠假單胞菌為代表的生物膜細(xì)菌造成的慢性上呼吸道感染中已得到廣泛應(yīng)用[31]。Cammarota等[32]開展了一項(xiàng)觀察 NAC 在耐藥幽門螺桿菌感染患者中療效的非盲隨機(jī)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，NAC處理組的幽門螺桿菌根除率高于對照組，且這一效應(yīng)不受幽門螺桿菌基因型的影響。NAC雖沒有直接針對幽門螺桿菌的活性，但其能夠通過降低感染部位黏液的厚度使得其他抗菌藥物(蘭索拉唑+克拉霉素)更好地被遞送;另外，NAC可能干擾了細(xì)菌的抗原決定簇，使細(xì)菌暴露在酸性環(huán)境中，導(dǎo)致了抗原的退化;同時(shí)其也降低了黏膜上的氧化劑含量，使得幽門螺桿菌感染期間炎癥反應(yīng)正常進(jìn)行[33]。

(二)中藥制劑治療

有研究顯示了一些中藥制劑如大黃素、黃連素、苦參堿、黃芩苷等對耐藥幽門螺桿菌存在抑制作用，在低于50%最小抑菌濃度 (minimal inhibitory concentration，MIC)時(shí)，這些藥物能明顯抑制耐藥幽門螺桿菌生物膜形成[34-35]。其原因可能是中藥提取物含有的有機(jī)硫化合物能夠穿過細(xì)菌細(xì)胞壁磷脂雙份子層，更容易破壞生物膜結(jié)構(gòu)的EPS，從而更好地滲入深層，起到殺菌作用。

(三)其他

Campli等[36]研究認(rèn)為，低頻電場在幽門螺桿菌生物膜中能夠誘導(dǎo)黏附細(xì)菌表型的改變，降低細(xì)菌的黏附，使細(xì)菌種群失去平衡，從而降低幽門螺桿菌自身保護(hù)的能力。另外，由于QS信號系統(tǒng)在幽門螺桿菌生物膜中起中心調(diào)節(jié)作用，國內(nèi)外學(xué)者設(shè)想它可能是一個(gè)控制感染性疾病的新靶點(diǎn)，希望通過它來對抗生物膜相關(guān)耐藥機(jī)制以達(dá)到治療目的，但其臨床意義有待進(jìn)一步研究。

五、問題與展望

對于幽門螺桿菌生物膜的研究目前僅處在初始階段，有很多基礎(chǔ)問題有待解決，包括生物膜的形成機(jī)制、形成過程中所需的條件和信號、細(xì)菌胞外基質(zhì)與宿主胞外基質(zhì)直接的相互作用、QS系統(tǒng)的起始和靶基因表達(dá)調(diào)節(jié)與交叉交流、細(xì)菌群體的功能性分工等，特別是在耐藥機(jī)制和遺傳性狀方面更需要深入研究。目前，幽門螺桿菌生物膜形成的相關(guān)基因是這一領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。另一方面，用于預(yù)防幽門螺桿菌感染的高效無毒疫苗已通過了動物試驗(yàn)[37]。這些都將為治療耐藥性幽門螺桿菌造成的臨床感染帶來希望。

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